[發明專利]農作物甲基化差異DNA標記連鎖圖譜的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 200810079374.1
• 申請日: 2008-09-10
• 公開（公告）號: CN101353703A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 孫毅;段永紅;梁小紅;錢錦;儀治本;閆敏
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 太原市科瑞達專利代理有限公司
• 代理人: 劉寶賢

技術領域

本發明涉及一種構建植物分子標記連鎖圖譜的新方法，特別是一種利用甲基化差異的DNA片段作為分子標記構建連鎖圖譜的方法，以及其應用于農作物輔助育種。

背景技術

DNA甲基化是活體細胞中最常見的一種DNA共價修飾現象，是在甲基轉移酶(甲基化酶)催化下將S-腺苷-甲硫氨酸上的甲基連接到DNA分子腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)堿基上，進行DNA修飾的過程。在大多數真核生物的細胞中，90％以上的甲基化作用都是發生在DNA的CpG雙堿基序列處，而且這些序列大部分被對稱地甲基化；在高等植物中，多數DNA甲基化發生在CpG二核苷酸對中的胞嘧啶5-碳原子上，但甲基化也常發生在CAG、CTG三核苷酸中和CCG基元中，常常是對稱發生的，也有非對稱序列甲基化的報道。DNA的甲基化是生物體中的表觀遺傳現象，即在發育過程中，雖然基因表達調控發生改變，但核苷酸序列沒有變化，它可以遺傳，也可能發生逆轉(脫甲基化)。在高等植物中，DNA攜帶著兩種形式的信息，即由核苷酸序列決定的遺傳信息和由它的結構決定的外遺傳信息。外遺傳信息是不處于DNA自身的核苷酸序列中的可影響DNA活性的任何可遺傳的物質，能夠控制基因的表達。DNA甲基化并不改變基因的堿基序列而是通過基因的表達以改變其功能。大量研究表明，DNA甲基化不僅可以遺傳，而且存在特定的動態變化模式。DNA甲基化是調節植物基因的一種表達方式，在基因表達調控中扮演了很重要的角色。DNA的甲基化修飾參與基因表達調控，胚胎發育、細胞分化、基因組印跡、X染色體失活和細胞記憶等諸多生物學過程，DNA發生甲基化可以關閉某些基因的活性，去甲基化后又可以重新誘導基因的活化表達，在植物轉基因的研究中，發現幾乎所有的轉基因沉默現象均與轉基因及其啟動子的甲基化有關，目前的研究認為發生在轉基因啟動子5’端的甲基化是造成轉錄水平基因沉默的主要原因。

不同生育期的植物以及植物的不同器官，由于基因表達模式的不同，會導致基因組總甲基化水平發生變化。而且不同植物在生長發育過程中甲基化水平變化的趨勢不同，不同器官間甲基化水平也有差異。基因甲基化模式的改變可以影響植物的花期、育性、花及葉片的形態等。找到控制不同器官甲基化差異表達的基因，可以研究其在植物生長發育過程中的特定時空表達和調控；對DNA甲基化水平進行研究，發現許多植物在雜交種中一些位點與親本相比表現為去甲基化，而另一些位點表現為甲基化水平增加，表明在雜交種中DNA甲基化水平的改變，導致新的基因調控系統的形成，通過與雜種優勢性狀的相關性分析，可進一步研究雜種優勢產生的分子基礎，有利于在早代就選出能產生雜種優勢的親本。

DNA甲基化分子標記是DNA甲基化水平遺傳變異的直接反映，為研究植物整個基因組甲基化水平的變化，利用甲基化差異的DNA片段作為分子標記構建連鎖圖譜很有意義。

發明內容

本發明目的是克服上述已有技術的不足，提供一種具有更直接與基因表達相關優勢的農作物甲基化差異DNA標記連鎖圖譜構建方法，并應用于農作物輔助育種。

從理論上講，根據植物不同生育期DNA甲基化的差異，可以構建不同發育時期的DNA甲基化圖譜，但通過長期的育種實踐工作可以發現，在植物整個基因組中發生DNA甲基化的敏感部位應該大體上是一致的，或者至少范圍不會有太大變化，只是在不同時期，敏感部位發生甲基化或去甲基化存在著差異。

本發明首先獲得甲基化特異性DNA片斷，然后根據甲基化差異片段在雜交親本之間的異同及其在雜交、回交等后代群體中的分離狀況，確定這些片段之間以及目的性狀與這些分離片段之間的連鎖強度。尋找與目標性狀緊密連鎖的甲基化差異DNA分子標記，從而構建該時期甲基化敏感的分子標記連鎖圖譜。本發明采用限制性內切酶--PCR方法獲得甲基化差異片段。

為了能夠檢測到盡可能多的某一發育階段生物體基因組甲基化位點，必須將DNA基因組完全消化，從而得到完全消化的DNA甲基化差異片段，用于構建DNA甲基化的分子標記連鎖圖譜。DNA甲基化差異分子標記連鎖圖譜既可以利用已有DNA分子標記連鎖圖及其上的標記作為錨定標記，確定已有圖譜上的標記與DNA甲基化差異標記間的距離，也可以全部采用DNA甲基化差異多態性標記單獨構建。