[發明專利]灰斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的微衛星標記技術

無效

• 申請號: 200810073839.2
• 申請日: 2008-10-17
• 公開（公告）號: CN101372711A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發明（設計）人: 李力;繆劍華;徐永莉
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區藥用植物園
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于動物中藥材分子生物學技術領域，具體涉及一種灰斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的微衛星標記技術。

背景技術

品種鑒定傳統上主要采用性狀鑒別、顯微鑒別、同工酶電泳等方法來鑒別品種(品系)的真偽和純度，這些方法都不同程度地存在缺陷，難以滿足商業化的技術需求。微衛星標記技術可以彌補傳統方法的缺陷，微衛星是指以幾個(1-6bp)核苷酸為單位，多次串聯重復序列，也稱之為簡單重復序列(singlesequence?repeats，SSR)、短串聯重復序列(short?tande?m?repeats，STR)或簡單序列長度多態性(single?sequence?length?polymorphism，SSLP)，廣泛分布于真核生物基因組中，大約每隔10-50bp就有一個微衛星，由于重復次數和重復程度的不完全而造成每一個位點的多態性，利用微衛星標記可以繪制品種(品系)的指紋圖譜，指紋圖譜是鑒別品種(品系)的有力工具，它具有迅速、準確、可靠等優點，在監測良種質量(真偽、純度)，防止偽劣品種流入市場，保護我國名、優、特種質的知識產權和育種家們的權益等方面具有重要意義。蛤蚧(Gekko?gecko)別名大壁虎、仙蟾、蛤蟹，陸棲的爬行動物。體背有灰色斑點的為灰斑蛤蚧，蛤蚧習居于山巖或樹洞內或居住在天花板墻壁上，主要分布于廣西、廣東、云南等地。蛤蚧可作為藥材，具有補肺腎，益精血，止咳定喘功用，有增強免疫力，延緩衰老，抗炎作用，主治虛勞咳嗽、氣喘、咯血、消渴等癥。

發明內容

本發明的目的在于提供一種可靠的品種鑒定技術方法灰斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的微衛星標記技術。這種灰斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的微衛星標記技術其技術步驟包括蛤蚧微衛星序列的獲得、微衛星引物設計、PCR擴增和擴增產物進行檢測；蛤蚧微衛星序列的獲得包括構建基因組文庫(300—800bp)，根據欲得到的蛤蚧SSR類型設計合成寡核苷酸探針，通過菌落原位雜交篩選所需的重組克隆對陽性克隆進行順序鑒定；對具高度專一性微衛星兩側序列進行蛤蚧微衛星引物設計，擴增同一種蛤蚧甚至不同種蛤蚧的其它基因型片段，微衛星引物在基因組中每一條引物長18-24bp；PCR擴增用的蛤蚧模板包括從蛤蚧全身所有皮膚、組織、器官、血液之一為對象而抽提而來的核基因組DNA或mtDNA中的同源片斷，以其為模板，用合成引物進行PCR擴增，擴增時需摻入同位素或其它在效果上可替代放射性物質的標記，對擴增產物進行分析；對擴增產物進行檢測包括擴增產物經變性(非變性)聚丙烯酰胺凝膠(0.5—12％濃度)電泳，凝膠干燥后通過放射性自顯影顯示結果，根據膠片上的條帶分布，分析樣本多樣性，同時包括用銀染來檢測擴增產物。本發明具有如下有益效果：利用微衛星標記技術鑒別品種(品系)具有迅速、準確、可靠等優點，在監測良種質量真偽和純度，防止偽劣品種流入市場，保護品種方面具有積極意義。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明的實質性內容作進一步詳細的描述。

灰斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的微衛星標記技術發明其步驟包括：蛤蚧微衛星序列的獲得、微衛星引物設計、PCR擴增、擴增產物進行檢測，其結果可用于構建蛤蚧遺傳圖譜、蛤蚧遺傳疾病診斷、蛤蚧群體(個體)位點多態性的檢測、檢測品種間親緣關系、標記輔助選擇、蛤蚧種群動態和進化歷史揭示等。蛤蚧微衛星序列的獲得:包括構建基因組文庫(300—800bp)，根據欲得到的蛤蚧SSR類型，設計合成寡核苷酸探針，通過菌落原位雜交篩選所需的重組克隆，對陽性克隆進行順序鑒定。蛤蚧微衛星引物設計:由于微衛星兩側序列具高度專一性，因此據此設計引物用以擴增同一種蛤蚧甚至不同種蛤蚧的其它基因型片段。微衛星引物在基因組中具有高度專一性，每一條引物長18-24bp，(G+C)百分含量接近50％(Tm60℃左右)。PCR擴增的模板及擴增:PCR擴增用的蛤蚧模板包括從蛤蚧全身所有皮膚、組織、器官、血液之一為對象而抽提而來的核基因組DNA或mtDNA中的同源片斷，以其為模板，用合成引物進行PCR擴增，擴增時需摻入同位素或其它在效果上可替代放射性物質的標記，以便對擴增產物進行分析。對擴增產物進行檢測:擴增產物經變性(非變性)聚丙烯酰胺凝膠(0.5-12％濃度)電泳，凝膠干燥后通過放射性自顯影顯示結果，根據膠片上的條帶分布，分析樣本多樣性，同時包括用銀染來檢測擴增產物，不會降低靈敏度。微衛星位點可經PCR擴增，具高質量信息，是共顯性標記物。