[發(fā)明專利]褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中的活性表達(dá)與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810073563.8
• 申請日: 2008-05-05
• 公開（公告）號(hào): CN101260394A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王青艷;楊登峰;黃日波;孫靚;陸雁;肖代俊;黃志民;黎貞崇
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N9/90
• 分類號(hào): C12N9/90;C12N15/61;C12N15/81;C12P1/02
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種木糖異構(gòu)酶的提取及應(yīng)用，具體涉及一種褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶的提取方法及其在釀酒酵母中的活性表達(dá)與應(yīng)用。

背景技術(shù)

木糖異構(gòu)酶(EC5.3.15)，既能催化木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，也能催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖，該酶可應(yīng)用于高果糖漿的生產(chǎn)。木糖異構(gòu)酶的另一重要潛在應(yīng)用在于可再生木質(zhì)纖維素資源的開發(fā)。木質(zhì)纖維素是年產(chǎn)量巨大且目前尚未被充分利用的可再生資源，其水解物中木糖的含量僅次于葡萄糖。當(dāng)前隨著能源危機(jī)和環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，對(duì)可再生資源的利用和尋求清潔能源是大勢所趨。燃料乙醇是最有發(fā)展前景的環(huán)境友好新型能源。因此利用木糖，特別是通過微生物轉(zhuǎn)化木糖產(chǎn)生乙醇，是解決能源危機(jī)和環(huán)境污染的途徑之一。促進(jìn)木糖向乙醇的生物轉(zhuǎn)化是充分利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，降低乙醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。因此，利用基因工程手段，拓展乙醇轉(zhuǎn)化的底物，對(duì)于木質(zhì)纖維素資源全利用具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

木糖代謝的研究已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，包括木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源的降解，具有直接發(fā)酵木糖成酒精能力的細(xì)菌、真菌及酵母菌種的選育，木糖發(fā)酵工程菌的構(gòu)建等。迄今為止已發(fā)現(xiàn)100多種微生物可代謝木糖，包括細(xì)菌、真菌和酵母。能利用木糖的細(xì)菌是在木糖異構(gòu)酶的作用下直接轉(zhuǎn)化木糖形成木酮糖。釀酒酵母菌由于缺乏將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶，而不能利用木糖。釀酒酵母是工業(yè)上生產(chǎn)酒精的優(yōu)良菌株，與細(xì)菌相比具有較高的乙醇耐受力，對(duì)纖維材料水解液中的抑制物有較高的抗性，但酵母菌只能代謝木糖的異構(gòu)體形式--木酮糖。木酮糖由木酮糖激酶催化形成5-磷酸木酮糖，然后進(jìn)入磷酸戊糖途徑(PPP途徑)，并經(jīng)糖酵解途徑或在厭氧條件下產(chǎn)生乙醇，或在好氧條件下經(jīng)TCA循環(huán)徹底氧化。引入細(xì)菌木糖異構(gòu)酶基因(xylA)是使釀酒酵母轉(zhuǎn)化木糖成為較易運(yùn)輸并可被釀酒酵母直接利用的木酮糖。由于直接完成木糖的木酮糖的轉(zhuǎn)化，并且不需要任何輔助因子，被認(rèn)為是構(gòu)建利用木糖釀酒酵母基因工程菌株的便利途徑。

目前很多科研工作者致力于構(gòu)建能直接發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒精的酵母工程菌，大腸桿菌(E.coli)、米蘇里游動(dòng)放線菌(A.missouriensis)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和乳糖桿菌(L.pentosus)??的木糖異構(gòu)酶基因xylA曾先后被克隆于釀酒酵母菌中，但均沒有得到有活性的表達(dá)。目前只有嗜熱(T.thermophilus)及高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(C.thermohydrosulfuricum)的木糖異構(gòu)酶基因xylA在釀酒酵母中得到了活性表達(dá)。鮑曉明等【嗜熱細(xì)菌木糖異構(gòu)酶基因xylA在釀酒酵母中的高效表達(dá)[J].微生物學(xué)報(bào)，1999，39(1)：49-54】采用PCR技術(shù)，克隆得到高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(C.thermohydrosulfuricum)木糖異構(gòu)酶基因(xylA)，并在釀酒酵母H158中得到活性表達(dá)，此外還利用輔酶工程手段，釀酒酵母工程菌株可以在木糖為唯一碳源的平板上生長；搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該工程菌株可以發(fā)酵木糖形成1.3g/L乙醇。

迄今為止，還未有將褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida?fusc，簡寫成T.fusca，下同)的木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中表達(dá)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

由于目前只有極少數(shù)細(xì)菌木糖異構(gòu)酶基因能在釀酒酵母中活性表達(dá)，在很大程度上制約了直接發(fā)酵木糖生產(chǎn)酒精的酵母工程菌的研究和利用。本發(fā)明的目的在于利用基因工程技術(shù)，提供一種能夠在釀酒酵母中得到活性表達(dá)并能應(yīng)用于發(fā)酵制備乙醇的褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶，獲得不同類型的重組菌株，為提高了釀酒酵母菌在厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的能力打下了基礎(chǔ)。

本發(fā)明人在分析嗜熱微生物的基因組時(shí)，發(fā)現(xiàn)可以用生物信息學(xué)的方法在一系列已注釋的脫氧核糖核酸中找到非常有用的信息。結(jié)合基因的克隆和異源基因表達(dá)技術(shù)，以及通過對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行特征鑒定，發(fā)現(xiàn)嗜熱菌T.fusca的木糖異構(gòu)酶基因經(jīng)過克隆和培養(yǎng)，在宿主中表達(dá)出具有酶活力的木糖異構(gòu)酶，使基因工程菌能以木糖、葡萄糖等為碳源發(fā)酵制得乙醇或其它發(fā)酵產(chǎn)物。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種木糖異構(gòu)酶(xylA)的提取方法，其特征在于所述的木糖異構(gòu)酶基因選自褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida?fusca)，提取方法包含以下步驟：