[發明專利]假高粱及其近似種PCR鑒定方法及其試劑盒

無效

• 申請號: 200810072360.7
• 申請日: 2008-12-12
• 公開（公告）號: CN101748191A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 郭瓊霞;黃嫻;黃振;虞赟;黃可輝;沈建國;王念武
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及檢疫性雜草假高粱及其近似種的種間鑒定技術領域，是一種用于快速鑒定假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的PCR方法及該方法所使用的試劑盒。

背景技術

假高粱是世界十大惡性雜草之一，我國已將其列入有害生物名單。假高粱的種子特征與擬高粱、蘇丹草等Sorghum屬其他種十分相似，加之口岸截獲的假高粱種子由于小穗軸，穎殼等特征部位易被擠壓而折斷、破損，給以種子鑒定為主的口岸檢疫工作帶來更大困難，因此，檢疫工作中急需一種可靠而快速的方法來解決這一難題。

目前針對假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草這五個物種的鑒定手段除了形態學之外，還有郭瓊霞(2006)等嘗試過rDNA?ITS區的RFLP分析，可將假高粱與擬高粱區分開來(郭瓊霞等，基于rDNA?ITS分析的假高粱鑒定方法[J].福建農業學報2006，21(1)：32-34.)。此種鑒定方法的鑒定范圍僅限于假高粱、擬高粱兩個物種，比本發明的鑒定范圍窄，且耗時長1倍左右。方雪恩等(2007)嘗試用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)通過檢測其醇溶蛋白以區分高粱、蘇丹草、黑高粱、假高粱以及一種雜交蘇丹草(方雪恩等，高粱屬A-PAGE圖譜的建立及在種子鑒定中的應用[J]，西北植物學報，2007，27(12)：2399-2403)，該鑒定方法以醇溶蛋白提取為基礎，本發明以DNA提取為基礎，供PCR所消耗的樣品量遠少于醇溶蛋白研究的所需樣品量，即本發明的樣品消耗量比前述方法少，且操作步驟更簡單，耗時更短。

發明內容

本發明的目的在于提供一種準確快速鑒定假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草這五個物種的鑒定方法及該方法所使用的PCR分子鑒定試劑盒，鑒定的方法包括：1.鑒別PCR；2.電泳檢測。試劑盒中包括3對PCR反應引物和標準圖譜。

一種快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法，包括提取種子DNA，普通PCR鑒別，PCR循環，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別與標準圖譜對比，其特征在于：所述的普通PCR鑒別步驟采用的引物為：

引物JH-1：5’-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3’

引物JH-2：5’-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3’

引物SK-1：5’-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3’

引物SK-2：5’-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3’

引物HS-1：5’-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3’

引物HS-2：5’-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3’。

前述方法中，所述的標準圖譜比對包括如下步驟：

利用引物JH進行PCR反應，與JH標準圖譜對比，若在250bp和280bp處產生條帶，則受試樣品為假高粱或黑高粱；

利用引物SK進行PCR反應，與SK標準圖譜對比，若在110bp處產生條帶，則受試樣品為絲克高粱；

利用引物HS進行PCR反應，與HS標準圖譜對比，若在250bp處有條帶，則受試物種為黑高粱；若在110bp和130bp處均有條帶，則受試物種為蘇丹草；

利用引物JH進行PCR反應，與JH及HS標準圖譜對比，若在250bp、280bp兩處均有特異條帶，而此樣品利用HS引物進行PCR反應未在250bp處產生特異條帶，則受試樣品為假高粱；

利用引物SK、HS、JH分別進行PCR反應后，并與JH、SK及HS標準圖譜對比，若都沒有出現特異性的條帶，則該受試物種為擬高粱。

一種前述的快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法所使用的PCR分子鑒定試劑盒，該試劑盒至少含有用于前述PCR反應的引物及標準圖譜。

本發明的優點在于：可解決假高粱及其近似種鑒定的難題，能在8小時內完成假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草這五個物種的鑒定工作。

附圖說明

圖1是引物JH?PCR電泳的標準圖譜。圖2是引物SK?PCR電泳的標準圖譜。圖3是引物HS?PCR電泳的標準圖譜。圖1至圖3中：數字1到5分別表示假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草，ck為清水對照，M為100bp?DNA?Ladder。

具體實施方式

一種快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法，其特征是采用下列步驟對受試樣品進行位點特異性PCR鑒別：

①種子DNA提取：按常規進行，用雙蒸水將受試樣品模板DNA濃度調節至50ng/ul。