[發明專利]利用分子標記技術區分鳳尾菇與糙皮側耳的方法

無效

• 申請號: 200810072137.2
• 申請日: 2008-11-18
• 公開（公告）號: CN101392288A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: 劉新銳;吳小平;謝寶貴;鄧優錦;朱堅
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域??本發明涉及一種利用分子標記技術鑒別食用菌的方法，確切地說是一種利用分子標記技術快速區分鳳尾菇與糙皮側耳的方法。

背景技術??鳳尾菇(pleurotus?pulmonarius(Fr，)Sing.)是熱帶和亞熱帶地區的一種食用菌。又稱印度鮑魚菇、環柄側耳等。鳳尾菇栽培粗放，生產周期短，出菇溫度范圍廣。

1974年印度首先開始人工栽培鳳尾菇。1980年鳳尾菇人工栽培技術引入我國，現分布各省栽培。在不少有關食用菌產量統計或栽培技術介紹的文章和書籍中，常見鳳尾菇與糙皮側耳歸在一起。鳳尾菇和糙皮側耳在子實體的形態上難以區分，雖然兩者在菌蓋顏色深淺、厚度，擔孢子大小有細微的差別，鳳尾菇的生長速度比糙皮側耳的快些，但僅憑這些特點仍然很難區分鳳尾菇與糙皮側耳；鳳尾菇與糙皮側耳的一個較顯著的差別是：兩者在野外發生的季節不同，在歐洲和北美糙皮側耳通常出現在深秋和冬季，而鳳尾菇的子實體則出現在仲夏和早秋。所以在生產上僅靠子實體形態判別它們，就可能引起菌種的混淆。

由于鳳尾菇和糙皮側耳在子實體的形態上難以區分，因此，探索快速鑒別鳳尾菇真偽的方法，主要是探索快速有效地鑒別鳳尾菇與糙皮側耳的方法。

發明內容??本發明的目的是提供一種利用分子標記技術快速區分鳳尾菇與糙皮側耳的方法，以免在科研和生產上引起混亂，造成不必要的損失。

本發明的利用分子標記技術區分鳳尾菇與糙皮側耳的方法，包括菌絲的培養與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴增、特異酶切片段標記的產生和酶切產物的電泳檢測；其特征在于

1、特異酶切片段標記的產生：在4～8μl?PCR擴增產物，加入1μl?HaeIII酶的酶切Buffer，0.3～1μl?HaeIII酶，2.2～2.8μl?ddH₂O，37℃水浴4～10h；所述HaeIII酶的酶切Buffer成份為100mmoL/L?Tris-HCl，pH7.5，100mmoL/L?MgCl₂，10mmoL/L?Dithiothreitol和500mmoL/L?NaCl；

2、酶切產物的電泳檢測：取HaeIII酶的酶切產物10μL，與2μL上樣緩沖液混勻，點樣于1.2％的瓊脂糖凝膠上，于0.5X?TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；經電泳檢測，分子量為425～435bp和175～185bp的DNA標記條帶，是鳳尾菇菌株的標志；分子量為235～245bp和175～200bp的DNA標記條帶，是糙皮側耳菌株的標志。所述上樣緩沖液：0.1％溴酚藍，40％蔗糖。

本發明的利用分子標記技術區分鳳尾菇與糙皮側耳的方法，該方法與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高、容易判斷、重復性好等優點。

1、檢測時間短：該檢測所需時間短，一般只需要2～3天，而常規的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少2個月的時間，形態學檢測需要綜合分析菌絲體階段與子實體階段的微觀與宏觀的特征，所需時間與出菇試驗相當。

2、準確性高、重復性好：本發明以基因組DNA為材料，DNA是穩定的遺傳物質，是區分物種的本質表現所在，而DNA序列中的保守序列更是穩定，是物種長期進化的分子標記，不易受外界因素等的影響，因此以保守序列開發的鑒定技術準確性高，有很強的重復性；然而常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗容易受到環境條件、鑒定者的知識水平等因素影響，已經造成判斷上的混亂。

3、容易判斷：本發明的判斷依據是在瓊脂糖電泳上出現的DNA標記條帶，DNA標記條帶少、清晰，一目了然，不會出現像常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗上模棱兩可的現象，而給判斷造成誤差。

附圖說明??圖1為HaeIII酶的酶切電泳圖；1～M為泳道編號；右側的數字表示DNA片段的分子量。圖中，1～5泳道和7～8泳道所示的分子量為430bp和182bp的DNA標記條帶，是鳳尾菇菌株的標志；6和9泳道所示的分子量為243bp和190bp的DNA標記條帶，是糙皮側耳菌株的標志。

具體實施方法??為了充分公開本發明的利用分子標記技術區分鳳尾菇與糙皮側耳的方法，以下結合實施例加以說明。

實施例一：利用分子標記技術區分鳳尾菇與糙皮側耳的方法

利用分子標記技術區分鳳尾菇與糙皮側耳的方法，具體包括以下步驟：

一、菌絲培養與收集

(一)若測試菌株保藏時間小于6個月，則菌絲培養按如下方法進行：

1、用接種耙耙碎含鳳尾菇菌絲的PDA培養基，轉接入250ml三角瓶，含100ml?PDA液體培養基中；