[發(fā)明專利]以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810071956.5
• 申請日: 2008-10-17
• 公開（公告）號: CN101372708A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發(fā)明（設計）人: 吳喬;劉晶晶;鄭忠輝;沈月毛
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/66;G01N21/76
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所
• 代理人: 馬應森

1.以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于包括以下步驟：

1)構(gòu)建一種含TR3應答元件及熒光素酶報告基因的報告質(zhì)粒pNurRE-Luc；

2)篩選穩(wěn)定表達報告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細胞株；

3)篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物。

2.如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于所述構(gòu)建一種含TR3應答元件及熒光素酶報告基因的報告質(zhì)粒pNurRE-Luc的具體步驟如下：

1)合成具備酶切識別位點的含TR3應答元件序列的片段；

2)將含TR3應答元件序列的片段克隆至質(zhì)粒pGL3-promoter的熒光素酶基因前的多克隆位點內(nèi)，獲得質(zhì)粒pGL3-NurRE；

3)以質(zhì)粒pGL3-NurRE為模板，PCR擴增出含f1復制起始位點、TR3應答元件、SV40啟動子、熒光素酶報告基因和終止子的片段，再插入到質(zhì)粒pEGFP-C3內(nèi)，獲得含TR3應答元件及報告基因的報告質(zhì)粒pNurRE-Luc。

3.如權(quán)利要求2所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于在步驟1)中，含TR3應答元件序列的片段序列如下：

5’-CTAGTGATATTTACCTCCAAATGCCAGTAGTGATATTTACCTCCAAATGCCAGC-3’。

4.如權(quán)利要求2所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于在步驟3)中，PCR擴增所用的引物對的堿基序列如下：

正向引物：5’-GATCGTGCACGCCCAAGCTACCATGATAAG-3’，下劃線標注的序列為限制性內(nèi)切酶ApaL?I的酶切位點；

反向引物：5’-CTGAGTGCACAGATCGCTGAGATAGGTGC-3’，下劃線標注的序列為限制性內(nèi)切酶ApaL?I的酶切位點。

5.如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于報告質(zhì)粒pNurRE-Luc的核心序列為熒光素酶報告基因、綠色熒光蛋白基因、新霉素抗性基因和TR3應答元件序列組成的重組DNA序列；或

通過所述含TR3應答元件序列的片段序列中的核苷酸的缺失、取代或增加而得到的核苷酸序列。

6.如權(quán)利要求5所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于所述報告質(zhì)粒pNurRE-Luc的核心序列的連接順序為TR3應答元件序列—熒光素酶報告基因—綠色熒光蛋白基因—新霉素抗性基因。

7.如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于所述篩選穩(wěn)定表達報告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細胞株的具體步驟如下：

1)以脂質(zhì)體方法將報告質(zhì)粒pNurRE-Luc轉(zhuǎn)染細胞；

2)通過檢測表皮生長因子對細胞克隆株的熒光素酶表達影響程度，在含終濃度200～500μg/ml新霉素的抗性培養(yǎng)基篩選出穩(wěn)定表達報告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細胞克隆株。

8.如權(quán)利要求7所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于所述細胞克隆株包括人胚腎293細胞、人胚腎293T細胞、鼠肝AML-12細胞，以及人胃腺癌BGC-823細胞，肝癌HepG2細胞。

9.如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于所述篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物采用瞬時轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒pNurRE-Luc的方法，包括以下步驟：

(1)將細胞株接種在培養(yǎng)板培養(yǎng)；

(2)以磷酸鈣沉淀法瞬時轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒pNurRE-Luc；

(3)去除培養(yǎng)基，加入含待測化合物的培養(yǎng)基；

(4)處理細胞后，去除培養(yǎng)液，加入細胞裂解液進行細胞裂解；

(5)用化學發(fā)光檢測儀測定細胞裂解液的熒光素酶活性，即篩選出調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物；

10.如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點的化合物篩選方法，其特征在于所述篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物采用應用穩(wěn)定表達報告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細胞株的方法，包括以下步驟：

(1)將細胞株接種在培養(yǎng)板培養(yǎng)；

(2)去除培養(yǎng)基，加入含待測化合物的培養(yǎng)基；

(3)處理細胞后，去除培養(yǎng)液，加入細胞裂解液進行細胞裂解；

(4)用化學發(fā)光檢測儀測定細胞裂解液的熒光素酶活性，即篩選出調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物。