[發(fā)明專利]一種靈芝雜交育種方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810071773.3
• 申請日: 2008-09-16
• 公開（公告）號: CN101352144A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發(fā)明（設計）人: 謝寶貴;林俊華;鄧優(yōu)錦
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H4/00;C12N1/14;C12R1/645
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1.一種靈芝雜交育種方法，包括靈芝親本菌株選擇、菌絲培養(yǎng)、再生培養(yǎng)基配制、菌絲裂解、單細胞再生、單核細胞分離、單核體雜交，雜交菌株培養(yǎng)并篩選，其特征在于

(1)靈芝親本菌株選擇：取廣東赤芝和靈芝5.75為雜交親本，轉(zhuǎn)接到PDA斜面中進行活化兩次；

(2)把經(jīng)2次活化好的菌種接種至PDA培養(yǎng)基中，放置搖床中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度為25度，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)每分鐘；PDA培養(yǎng)基由市場購得；

(3)再生培養(yǎng)基配制：葡萄糖10.0g·L^-1、麥芽糖5.0g·L^-1、酵母膏5.0g·L^-1、氯化鉀44.73g·L^-1、固化培養(yǎng)基添加瓊脂20g·L^-1；

(4)菌絲裂解，是將經(jīng)過2次活化、處于生長對數(shù)期中期的親本液體菌絲分別放入離心管中，離心后取沉淀，并加入無菌水清除菌絲外壁的雜質(zhì)，再用穩(wěn)滲液清洗，將清洗后的菌絲懸浮于溶壁酶液，于30℃的循環(huán)水浴鍋中恒溫水浴至單細胞完全釋放，得單細胞裂解液；

(5)單細胞再生，即離心單細胞裂解液，取沉淀，并用再生培養(yǎng)基清洗沉淀至單細胞外不含溶壁酶，然后用再生培養(yǎng)基稀釋至單細胞濃度為2～3個/低倍鏡視野，將單細胞稀釋液涂布至再生培養(yǎng)基平板中，并倒置培養(yǎng)皿于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至單細胞開始萌發(fā)；

(6)單核細胞分離，是從單細胞萌發(fā)的培養(yǎng)皿中挑取單個已長出芽管的單細胞連同培養(yǎng)基放入斜面培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)，長出3～5cm的菌落時，鏡檢挑取無鎖狀聯(lián)合的菌株；

(7)單核體雜交：將20mlCM培養(yǎng)基裝入干凈的培養(yǎng)皿中，兩個配對菌株相距1cm接種，25℃下培養(yǎng)7天，當兩個菌株的菌落相互接觸后，挑取交接處的菌絲；

(8)雜交菌株培養(yǎng)并篩選：常規(guī)方法培養(yǎng)所獲得的雜交菌株，并從中篩選出雜種優(yōu)勢強、相對性狀優(yōu)良的雜交菌株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靈芝雜交育種方法，其特征在于菌絲裂解的具體步驟如下：

(1)把在PDA培養(yǎng)基中已經(jīng)長成的菌絲移入7ml的離心管中，每管5ml，赤芝與靈芝5.75各兩管；

(2)將步驟(1)移好菌液的離心管放入高速離心機中10000rpm離心10min；

(3)將步驟(2)離心過的離心管取出，倒出上清液，加入無菌水，振蕩后再次放入高速離心機中以10000rpm離心10min；

(4)將步驟(3)離心過的離心管取出，倒出上清液，加入穩(wěn)滲液洗滌，振蕩后再次放入高速離心機中離心；

(5)將步驟(4)離心過的離心管取出，用無菌濾紙過濾去溶液后，將收集的菌絲在無菌濾紙上吸干水份，稱取0.5g菌絲，放入干凈的離心管中；

(6)稱取100mg溶壁酶加入另一個干凈的離心管，加入5ml穩(wěn)滲液，制得溶壁酶液；

(7)向步驟(5)放入菌絲的離心管中加入2.5ml溶壁酶液，振蕩；

(8)把步驟(7)加入溶壁酶液的離心管放入循環(huán)水浴器中30℃水浴2.5～3.0h，其間5～10分鐘振蕩一次，至單細胞完全釋放，得單細胞裂解液；具體方法：從離心管中取少量溶液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下檢查單細胞數(shù)量，至確定單細胞完全釋放。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靈芝雜交育種方法，其特征在于單細胞再生的具體步驟如下：

(1)將裝有單細胞裂解液的離心管放入離心機中，于4℃，1000rpm離心20min；

(2)將離心過的離心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml穩(wěn)滲液洗滌后再放入離心機以4℃，1000rpm離心20min；

(3)將步驟(2)離心過的離心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml再生培養(yǎng)基，放入離心機，于4℃，1000rpm離心20min；

(4)將步驟(3)離心過的離心管取出，倒去上清液，加入再生培養(yǎng)基稀釋，稀釋后各取一小滴溶液于載玻片上，蓋上蓋玻片后放上顯微鏡觀察，使單細胞濃度為2～3個/低倍鏡視野；

(5)將稀釋后的單細胞液涂平板，每皿涂布0.5ml，倒置平板培養(yǎng)皿于25℃下培養(yǎng)48小時，單細胞開始萌發(fā)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靈芝雜交育種方法，其特征在于單核細胞分離的具體步驟如下：

(1)將平板培養(yǎng)皿放于顯微鏡下尋找已萌發(fā)并長出芽管的單細胞，且周圍其他部分無相同菌絲；

(2)點燃酒精燈，將接種針于酒精燈上燒紅，在顯微鏡下挑取單個已萌發(fā)并長出芽管的單細胞連同一小塊培養(yǎng)基的，并確保培養(yǎng)基上無其他單細胞；

(3)在火焰處拔出斜面培養(yǎng)基上的硅膠塞，將挑出的培養(yǎng)基塊放入，塞回硅膠塞，放于25℃下培養(yǎng)讓其生長；

(4)當長出3～5cm的菌落時，無菌操作挑取少量菌絲，顯微鏡下檢查是否有鎖狀聯(lián)合，挑取無鎖狀聯(lián)合的菌株。