[發明專利]抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 200810071473.5
• 申請日: 2008-07-24
• 公開（公告）號: CN101633694A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 任宏偉;鄒宇飛;熊玲媛;馬彬云;孫朗;楊幼瑤;馬凌燕;付永超;吳敏華
• 申請（專利權）人: 任宏偉;鄒宇飛
• 主分類號: C07K16/22
• 分類號: C07K16/22;C07K1/14;G01N33/68
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明涉及抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的制備方法，和檢測神經生長因子(NGF)的ELISA試劑盒。?

背景技術

神經生長因子(nerve?growth?factor，NGF)是意大利科學家Levi-Montalcini?1953年發現的神經營養因子，是目前研究最為透徹的，具有神經元營養和促突觸生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，它對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。1960年，美國科學家Cohen提取純化NGF，并證明其生物活性。1986年，Montalcini和Cohen因對NGF的杰出研究而榮獲諾貝爾生理醫學獎。90年代至今，國內外多家制藥公司和藥物研究機構相繼開始進行NGF開發研究。目前已開發出多種NGF試劑。?

NGF包括α、β、γ三個亞單位，其中α亞單位功能尚不清楚，γ亞單位具有蛋白酶活性，β亞單位是NGF的活性亞單位。活性區β亞單位由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結合而成的二聚體。NGF在人體內主要分布于腦、神經節、虹膜、心臟、脾、胎盤等組織及成纖維細胞、平滑肌、骨骼肌、膠質細胞、雪旺氏細胞等。?

目前NGF主要來源于雄性小鼠頜下腺(與人類NGF有90％同源性)、牛精漿、蛇毒、和豚鼠前列腺。分子量為140kD(7s?NGF，由α、β、γ三個亞單位和鋅離子構成)和13kD～14kD(2.5s?NGF，結構與β亞基基本相同。故又稱為β-NGF)。?

NGF與受體結合，通過受體介導的內吞機制產生內在化，形成由軸膜包繞、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，經軸突沿微管逆行轉運至胞體，經酪氨酸蛋白激酶、酯酰肌醇鈣、內源性環腺苷酸等第二信使體系的轉導，啟動一系列級聯反應，對靶細胞的某些結構或功能蛋白基因表達進行調控而發揮其生物效應。?

定性和定量地測定神經生長因子(NGF)的活性，對醫藥領域具有重大的作用。現有的NGF質量控制標準是采用雞胚背根神經節法，測定NGF的生物學活性，由于該法實驗誤?差大，結果判定易受主觀因素影響。所以建立快速、準確、客觀的NGF含量的測定方法，不僅有利于NGF質量控制，也可用于NGF的藥代動力學研究，但這都需要NGF抗體的制備的獲得和檢測方法的建立。由于NGF的免疫原性較弱，很難獲得抗體，在國內NGF高效價抗體獲得還是一個空白。本發明通過特殊處理的NGF免疫兔子獲得了高效價的NGF抗體，并將其制成檢測試劑盒。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種制備抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的方法；?

本發明的另一目的在于利用上述方法制備的多克隆抗體，制備一種可以定量檢測神經生長因子(NGF)的ELISA試劑盒，來檢測不同細胞、組織中神經生長因子(NGF)的定位及表達；該試劑盒可檢測血、培養上清、細胞、組織等不同樣品中神經生長因子(NGF)。?

為了解決上述問題，本發明采用的技術方案是：?

一種抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的制備方法：?

采用純化的鼠頜下腺神經生長因子(NGF)作免疫原，采用戊二醛聚合NGF后，免疫正常家兔，收集血清，從中分離純化出抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體。?

前述的一種抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體制備方法，包括以下步驟：?

a、純化的NGF經0.1％-0.5％戊二醛聚合后按照10μg～500μg/只，與等體積完全弗氏佐劑充分混合、乳化，皮下多點注射正常家兔；?

b、2周～4周后，純化的并經0.1％-0.5％戊二醛聚合的NGF與等體積不完全弗氏佐劑充分混合、乳化，再次皮下多點注射；?

c、2周～4周后，重復步驟b；?

d、末次免疫一周后采耳血，間接ELISA方法測效價，大于1∶1000即可；?

e、耳緣靜脈采血，收集血清，-20℃保存。?

前述的制備的抗鼠神經生長因子(NGF)多克隆抗體的制備，還包括以下純化步驟：?

(1)、制備抗原親合柱：?

(2)、結合緩沖液(PBS)充分平衡抗原偶聯的親和層析柱；?

(3)、兔多克隆免疫血清與PBS混合后，反復上樣3次；?

(4)、PBS充分洗滌，去除未結合蛋白；?

(5)、洗脫緩沖液洗滌特異結合的抗免疫抗原的多克隆抗體，收集至加有適量10×PBSpH7.6的燒杯中；?