[發(fā)明專利]抗鼠神經(jīng)生長因子(NGF)的多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810071473.5
• 申請日: 2008-07-24
• 公開（公告）號: CN101633694A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任宏偉;鄒宇飛;熊玲媛;馬彬云;孫朗;楊幼瑤;馬凌燕;付永超;吳敏華
• 申請（專利權(quán)）人: 任宏偉;鄒宇飛
• 主分類號: C07K16/22
• 分類號: C07K16/22;C07K1/14;G01N33/68
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張松亭

1.一種抗鼠神經(jīng)生長因子的多克隆抗體的制備方法，采用純化的鼠頜下腺神經(jīng)生長因子作免疫原，采用戊二醛聚合NGF后，分批次免疫正常家兔，加強(qiáng)免疫后一周收集血清，從中分離純化出抗鼠頜下腺神經(jīng)生長因子的多克隆抗體，其具體步驟是：

a、純化的NGF經(jīng)0.1％-0.5％戊二醛聚合后與等體積完全弗氏佐劑充分混合、乳化，皮下多點(diǎn)注射正常家兔，注射劑量為10μg～500μg/只；

b、2周～4周后，純化的并經(jīng)0.1％-0.5％戊二醛聚合的NGF與等體積不完全弗氏佐劑充分混合、乳化，再次皮下多點(diǎn)注射，注射劑量為10μg～500μg/只；

c、2周～4周后，重復(fù)步驟b；

d、末次免疫一周后采血，收集血清，-20℃保存；

還包括以下的抗體純化步驟：

(1)、制備抗原親合柱：純化的小鼠頜下腺神經(jīng)生長因子透析于偶聯(lián)緩沖液中，預(yù)冷的0.5mM～50mM?HCl洗滌CNBr活化的sepharose?4?fast?flow膠數(shù)次，負(fù)壓超濾，并置換于偶聯(lián)緩沖液中；將抗原與活化的膠?；旌希?℃攪拌過夜；用偶聯(lián)緩沖液洗滌未完全結(jié)合的抗原；封閉緩沖液室溫作用0.5小時以上，封閉未被抗原飽和的活化位點(diǎn)；洗滌緩沖液交替洗滌2次以上，偶聯(lián)抗原的膠粒保存于20％的酒精中：其中，偶聯(lián)緩沖液為0.1mol/LNaHCO₃，0.5mol/L?NaCl，pH8.3；封閉緩沖液為0.2mol/L甘氨酸；洗滌緩沖液為：0.1mol/LCH₃COO·Na和0.5mol/L?NaCl，pH4.0；

(2)、PBS充分平衡抗原偶聯(lián)的親和層析柱；

(3)、兔多克隆免疫血清與PBS混合后，反復(fù)上樣2-4次；

(4)、PBS充分洗滌，去除未結(jié)合蛋白；

(5)、洗脫緩沖液洗滌特異結(jié)合的抗免疫抗原的多克隆抗體，收集至加有適量10×PBSpH7.6的燒杯中；透析至1×PBS中，蛋白定量，分裝，-20℃保存，其中，洗脫緩沖液為0.1M鹽酸-甘氨酸緩沖液，pH?2.8。

2.一種檢測神經(jīng)生長因子的試劑盒，其特征在于：該試劑盒含有權(quán)利要求1所述方法制備的多克隆抗體。

3.如權(quán)利 要求2所述的一種檢測神經(jīng)生長因子的試劑盒，其中所述的試劑盒還包括檢測?抗體、神經(jīng)生長因子標(biāo)準(zhǔn)品、Turbo-TMB底物、ELISA板。?