[發明專利]鼠神經生長因子的制備方法和注射用鼠神經生長因子的制備方法

有效

• 申請號: 200810071315.X
• 申請日: 2008-06-27
• 公開（公告）號: CN101613394A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 熊玲媛;任宏偉;孫朗;陳遠志;馬凌燕;楊佑瑤
• 申請（專利權）人: 熊玲媛;任宏偉;廈門北大之路生物工程有限公司
• 主分類號: C07K1/34
• 分類號: C07K1/34;C07K1/18;C07K14/48;A61K9/19;A61K38/18
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明涉及一種鼠神經生長因子的制備方法和注射用鼠神經生長因子的制備方法，尤 其涉及一種使用新型的病毒滅活法制備鼠神經生長因子的方法。

背景技術

鼠神經生長因子(NGF)是從小鼠頜下腺中分離純化的神經生長因子的凍干制品，其 傳統制備工藝為：將小鼠頜下腺組織勻漿，得勻漿上清液；然后將勻漿上清液離心、去沉 淀后，上離子交換層析I，收集流穿液；流穿液進行酸化解離、離心，得酸解上清液；酸 解上清液上離子交換層析，收集目標蛋白峰，即得神經生長因子原液；再加入賦形劑甘露 醇和穩定劑人血白蛋白，經除菌過濾后，分裝，凍干得制品。

由于鼠神經生長因子來源于小鼠，因而該制品存在生物安全性問題，主要是鼠源性病 毒對原材料頜下腺的污染或潛在性污染。為了保證該制品的安全性，在控制供體鼠飼養環 境和原材料頜下腺質量的同時，研究生產過程中去除或滅活病毒工藝對制品的安全性起著 十分重要的作用。

對于血液制品來說，國內外較成熟的病毒滅活/去除工藝方法有巴氏消毒法、干熱法、 有機溶劑/去污劑法、納米膜過濾法、光化學法等，但對于動物源性生化提取制品尤其是 規?；a量的鼠神經生長因子的病毒滅活工藝，國內外報道很少。

有機溶劑/去污劑法是利用有機溶劑和去污劑的配伍，破壞病毒的脂質包膜，使其失 去傳染性，從而達到滅活病毒的目的。但該方法對非脂包膜病毒沒有去除作用，并且人為 引入了有機溶劑和去污劑，而徹底清除有機溶劑和去污劑有很大難度，因而加大了產品污 染的風險；納米膜過濾法主要利用病毒顆粒和蛋白分子的大小差異通過納米級的濾膜把病 毒除去，適用于分子量較小(直徑較小)的蛋白，不適于較大直徑蛋白制品的病毒去除， 且納米膜價格昂貴；光化學法是利用某些光敏劑對病毒表面及病毒核酸結構有強烈的親和 性，在適當波長的光照下易激活，從而通過光化學作用破壞與其接觸的病毒結構，但是光 化學法對神經生長因子蛋白的活性損傷較大；巴氏消毒法屬熱力處理滅活病毒方法，即通 過熱量使病毒蛋白變性，破壞病毒結構進而滅活病毒，對脂質膜病毒及非脂質膜病毒均能 有效去除，臨床記錄顯示：巴氏消毒法是目前病毒滅活方法中最可靠的方法。但熱力也常 使蛋白制品變性或生物學活性降低。如何能既保持神經生長因子活性，又能徹底地去除病 毒，這是目前尚待解決的問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種鼠神經生長因子的制備方法，以解決現有技術中的上述問 題。本發明中的鼠神經生長因子的制備方法在傳統工藝中加入100KD和5KD超濾膜過濾和 巴氏消毒工藝，可有效過濾大分子病毒，同時通過巴氏消毒法進一步滅活偽狂犬病毒 (PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，既不引入任何外來有機溶劑 和去污劑等污染物，又能保持鼠神經生長因子注射液的高純度、高比活及高安全性。

本發明還有一個目的是提供一種注射用鼠神經生長因子的制備方法。

本發明采用的技術方案如下：

一種鼠神經生長因子的制備方法，將小鼠頜下腺組織勻漿，反復凍融破碎細胞，離心 去沉淀，得勻漿上清液；勻漿上清液去除細胞碎片后上陽離子交換層析I，收集流穿液， 流穿液進行酸化解離、離心，得酸解上清液；將酸解上清液上陽離子交換層析II，收集 目標蛋白峰，得蛋白收集液，其特征在于：將蛋白收集液進行超濾結合巴氏消毒法去除病 毒，再經超濾濃縮，除菌過濾后制得。

前述鼠神經生長因子的制備方法中，將蛋白收集液進行100KD超濾膜過濾后，將100KD 超濾膜濾下液用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至1～40μg/ml，在55～65℃水浴中恒溫 1～12小時，然后經5KD超濾膜和除菌過濾制得神經生長因子原液。

100KD超濾膜過濾可去除液體中的大分子病毒；在55～65℃水浴中恒溫1～12小時， 可有效滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，并保 持所制得的鼠神經生長因子的生物學活性；5KD超濾膜過濾可在濃縮樣品的同時轉換緩沖 液。

前述鼠神經生長因子的制備方法中，所述100KD超濾膜濾下液優選用注射用水或注射 用生理鹽水稀釋至5～30μg/ml，特別優選用注射用生理鹽水稀釋至20μg/ml。