[發明專利]利用細胞自發熒光光譜測定細胞周期的方法

無效

• 申請號: 200810070303.5
• 申請日: 2008-09-16
• 公開（公告）號: CN101363836A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發明（設計）人: 林曉鋼;潘英俊;郭永彩;高潮
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48;G01N21/64;C12Q1/02
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 張先蕓

技術領域

本發明涉及一種測定細胞周期的方法，特別涉及一種利用細胞自發熒光光譜準確反映 細胞周期變化的方法。

背景技術

細胞作為生命科學研究的基礎，一切生命的關鍵問題都要從細胞中尋找。生物的生殖 發育、遺傳、神經(腦)活動等重大生命現象的研究都要以細胞為基礎。植物與動物生長 發育是依靠細胞增殖、細胞分化與細胞凋亡來實現的，一切疾病的發病機制也要以細胞病 變研究為基礎。細胞分裂是生命起源最基本也最重要的過程。細胞生長和細胞分裂是所有 生物增殖的基本形式，細胞生長和細胞分裂的周期即為細胞增殖周期簡稱細胞周期(cell cycle)。對于真核細胞而言，其細胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，它是細胞全 部生理過程的綜合體現，普遍存在于高等生物中。目前，細胞周期及其調控機制已在腫瘤、 干細胞移植、衰老、生殖和遺傳學等領域顯示出巨大的指導意義。

目前，對于細胞周期進行判定的研究方法主要有以下幾種：光學顯微鏡法、流式細胞 儀分析法(DNA含量分析)、3H-TdR標記法等。光學顯微鏡法主要是通過顯微鏡對細胞 的形態進行觀察以判斷細胞所處細胞周期，該方法是通過人眼觀察，判斷速度慢；流式細 胞儀分析法在細胞周期研究中應用廣泛，但價格昂貴。從DNA含量入手，G1期和G2/M 期含有固定的DNA含量，分別為1倍和2倍，S期細胞的DNA含量介于1倍和2倍之間， 應用流式細胞儀就可通過監測細胞DNA含量的變化確定細胞周期的長短。但是由于G2 期和M期細胞的DNA含量都是2倍，故流式細胞儀無法區分G2期和M期細胞。3H-TdR 標記法是測定細胞的一種經典方法。但其測量中使用的放射性同位素要求專門設備，很容 易對操作者造成傷害和對環境造成污染，同時放射性同位素本身對細胞周期也有干擾且不 可避免。

細胞在細胞周期的變化過程中，細胞內部的氨基酸、蛋白質、核酸等物質都將隨著細 胞的生長變化發生巨大的變化。組織細胞的熒光有兩種：一種是自發熒光，一種是繼發熒 光。自發熒光是指細胞或組織不經熒光色素染色，在紫外光或短波長光的照射下所發出的 熒光。組織細胞經熒光色素染色后，細胞內某些成分和熒光色素結合后而呈現的熒光稱為 繼發性熒光。上述兩種熒光光譜的變化都可以反應細胞周期的變化，其中自發熒光的變化 主要由蛋白質中的芳香族氨基酸和核酸引起，繼發性熒光是熒光色素和細胞內的某些特定 成分結合后而呈現出不同顏色的專一性熒光，雖然這種熒光較強便于觀察，但是用于產生 繼發性熒光的熒光色素或染劑可能給細胞帶來未知的副作用，給細胞生長造成影響。因此 利用細胞的自發熒光光譜法直接對細胞中的熒光團進行研究。核酸和蛋白質是細胞中產生 熒光的非常重要的兩類物質。核酸的熒光量子產率很低，給檢測帶來較大的難度。蛋白質 構成細胞的大部分，占細胞干重的一半以上，在300～350nm范圍顯示出強熒光，它與生命 活動息息相關，在生物體內具有多種多樣的功能。蛋白質固有熒光性質使得利用熒光光譜 法對其進行研究具有獨特的優勢，它具有天然熒光主要是因為芳香族氨基酸——酪氨酸、 色氨酸和苯丙氨酸。它們的相對熒光強度比為100:9：0.5，苯丙氨酸的最大發射波長為 282nm，酪氨酸304nm，色氨酸340nm。

目前，國內外通過建立細胞自發熒光光譜模型以對細胞的細胞周期進行判斷還未見報 道。

發明內容

針對現有技術中存在的上述不足，本發明的目的是提供一種能夠對真核細胞的細胞周 期各階段(G1期、S期、G2期和M期)進行判斷的簡便方法，將細胞的熒光光譜信息同 細胞生長行為以及細胞增殖過程中生物化學反應對細胞內蛋白質的影響聯系起來對細胞 周期進行判斷。

本發明的目的是這樣實現的：利用熒光光譜法測定細胞周期的方法，其特征在于包括 如下步驟：1)將某種細胞的單個細胞作為一個變化體系，用處于正常生長狀態下的細胞 周期G1期、S期、G2期和M期的單個細胞制成標準樣品。利用熒光分光光度計或熒光光 譜儀測出被測細胞標準樣品的最佳激發波長，即以該波長照射樣品時，能獲得相對強度最 大的熒光譜；

首先用250nm為激發波長在250～700nm范圍進行掃描，得到細胞在250nm情況下的發 射光譜過后，測量250nm到發射光譜中的第一個熒光峰波長之間的激發光譜，找到激發光 譜中熒光強度最強的峰，這個峰所對應的波長即為被測細胞樣品的最佳激發波長，最后以 最佳激發波長做激發光測量該波長到700nm間的熒光光譜，掃描間隔0.1nm；