[發明專利]細胞質DNA的提取方法

無效

• 申請號: 200810070110.X
• 申請日: 2008-08-13
• 公開（公告）號: CN101338310A
• 公開（公告）日: 2009-01-07
• 發明（設計）人: 胡義德;孫恒文;劉麗紅;錢海洪
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所
• 代理人: 郭云

技術領域

本發明涉及從細胞中提取DNA的方法，特別是一種提取細胞DNA的方法。

背景技術

真核細胞擁有兩種類型DNA。一種是核DNA(nDNA)，它是目前受到高度重視的研究對象。另一種是細胞質DNA(mtDNA)，它位于線粒體內，僅占細胞總DNA量的百萬分之一到百分之一。與nDNA相比，細胞質DNA具有不同的遺傳密碼和分子結構。人類細胞質DNA是一個閉合、環狀的雙鏈DNA分子，由16569個堿基對(base?pair，bp)構成，其核苷酸序列已完全清楚。研究表明，人類神經退行性疾病、糖尿病以及衰老的發病與細胞質DNA突變密切相關。惡性腫瘤細胞細胞質DNA分子結構及表達調控研究已逐漸成為研究的熱點。獲取細胞質DNA也是從事線粒體和葉綠體遺傳研究的基礎。傳統的細胞質提取DNA方法分兩步提取，即首先將細胞中的線粒體或葉綠體分離出來，再進行抽提，其操作過程繁瑣，需要耗費大量的時間和實驗材料，所得細胞質DNA質量不穩定，且數量有限。

發明內容

本發明的目的在于提供一種細胞質DNA的提取方法，通過該方法直接將細胞質DNA從細胞中提取，避免了傳統分兩步抽提的弊端，且抽提效率高，所得細胞質DNA質量穩定。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種細胞質DNA的提取方法，包括(1)從人體或動物體的細胞組織獲得單細胞，或從人體或動物體的外周血中獲得外周白細胞的步驟，其關鍵在于還有下列步驟：

(2)細胞、線粒體的裂解及DNA的變形與復性

向裝有細胞的離心管中加入溶液A，所加入溶液A的量按每10⁷個細胞加140～160μl計，在冰浴中吹吸均勻，然后加入溶液B，加入溶液B的量按每10⁷個細胞加290～310μl計，顛倒混勻，然后放在冰浴中5～10分鐘，再加入溶液C，加入溶液C的量按每10⁷個細胞加215～235μl計，再混勻，然后放在冰浴中20～30分鐘；

上述溶液A中各溶質及其濃度為：葡萄糖55mmol/L，EDTANa₂·2H₂O50mmol/L，Tris-HCl?0.025mmol/L；

上述溶液B中各溶質及其濃度為：SDS?1％，NaOH?0.2mol/L；

上述溶液C中各溶質及其濃度為：鉀離子3mol/L，乙酸根離子5mol/L；

(3)細胞質DNA的提取

將復性完畢的溶液離心，取上清液，再加入上清液1/2體積的Tris飽和酚，振蕩混勻，再加入上清液1/2體積的氯仿-異戊醇，氯仿與異戊醇的體積比為24∶1，再振蕩混勻，然后離心，取上層水相；

(4)細胞質DNA的純化

加入所取上層水相等體積的異丙醇，冰浴25～40分鐘，離心，棄上層水相，用0℃65％～75％乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清層，沉淀干燥后得細胞質DNA。

本發明所述的細胞質DNA的提取方法，采用以下過程：單細胞或外周白細胞——細胞、線粒體的裂解——DNA變形與復性——DNA提取及純化，直接從細胞中提取細胞質DNA，所得DNA樣品完全可以滿足常規分子生物學和分子遺傳學如PCR分析、DNA探針的制備、DNA雜交以及限制酶譜的構建等研究工作的需要。大大提高了DNA的提取效率，而且成功率為100％。

作為優選實施例，在步驟(2)中，加入所述溶液A的溫度為0℃～6℃。

作為優選實施例，在步驟(2)中，加入所述溶液B的溫度為15℃～25℃。

作為優選實施例，在步驟(2)中，加入所述溶液C的溫度為0℃～6℃。

作為優選實施例，在步驟(3)中，復性完畢的溶液的離心條件為：離心加速度9000～11000g，離心時間5～10分鐘，離心溫度2℃～6℃。

作為優選實施例，在步驟(3)中，加入氯仿-異戊醇后的離心條件為：離心加速度9000～11000g，離心時間8～15分鐘，離心溫度2℃～6℃。

作為優選實施例，在步驟(4)中，加入異丙醇后的離心條件為：離心加速度：14000～16000g，離心時間：8～15分鐘，離心溫度：2℃～6℃。

作為優選實施例，在步驟(4)中，加入乙醇后的離心條件為：離心加速度14000～16000g，離心時間2～3分鐘，離心時溫度：2℃～6℃。

與現有提取方法相比，本發明的有益效果是：