[發明專利]細胞質DNA的提取方法

無效

• 申請號: 200810070110.X
• 申請日: 2008-08-13
• 公開（公告）號: CN101338310A
• 公開（公告）日: 2009-01-07
• 發明（設計）人: 胡義德;孫恒文;劉麗紅;錢海洪
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所
• 代理人: 郭云

1.一種細胞質DNA的提取方法，包括(1)從人體或動物體的細胞組織獲得單細胞，或從人體或動物體的外周血中獲得外周白細胞的步驟，其特征在于還有下列步驟：

(2)細胞、線粒體的裂解及DNA的變形與復性

向裝有細胞的離心管中加入溶液A，所加入溶液A的量按每10⁷個細胞加140～160μl計，在冰浴中吹吸均勻，然后加入溶液B，加入溶液B的量按每10⁷個細胞加290～310μl計，顛倒混勻，然后放在冰浴中5～10分鐘，再加入溶液C，加入溶液C的量按每10⁷個細胞加215～235μl計，再混勻，然后放在冰浴中20～30分鐘；

上述溶液A中各溶質及其濃度為：葡萄糖55mmol/L，EDTANa₂.2H₂O50mmol/L，Tris-HCl?0.025mmol/L；

上述溶液B中各溶質及其濃度為：SDS?1％，NaOH?0.2mol/L；

上述溶液C中各溶質及其濃度為：鉀離子3mol/L，乙酸根離子5mol/L；

(3)細胞質DNA的提取

將復性完畢的溶液離心，取上清液，再加入上清液1/2體積的Tris飽和酚，振蕩混勻，再加入上清液1/2體積的氯仿-異戊醇，氯仿與異戊醇的體積比為24∶1，再振蕩混勻，然后離心，取上層水相；

(4)細胞質DNA的純化

加入所取上層水相等體積的異丙醇，冰浴25～40分鐘，離心，棄上層水相，用0℃65％～75％乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清層，沉淀干燥后得細胞質DNA。

2.根據權利要求1所述的細胞質DNA的提取方法，其特征在于：在步驟(2)中，加入所述溶液A的溫度為0℃～6℃。

3.根據權利要求1所述的細胞質DNA的提取方法，其特征在于：在步驟(2)中，加入所述溶液B的溫度為15℃～25℃。

4.根據權利要求1所述的細胞質DNA的提取方法，其特征在于：在步驟(2)中，加入所述溶液C的溫度為0℃～6℃。

5.根據權利要求1所述的細胞質DNA的提取方法，其特征在于：在步驟(3)中，復性完畢的溶液的離心條件為：離心加速度9000～11000g，離心時間5～10分鐘，離心溫度2℃～6℃。

6.根據權利要求1所述的細胞質DNA的提取方法，其特征在于：在步驟(3)中，加入氯仿-異戊醇后的離心條件為：離心加速度9000～11000g，離心時間8～15分鐘，離心溫度2℃～6℃。

7.根據權利要求1所述的細胞質DNA的提取方法，其特征在于：在步驟(4)中，加入異丙醇后的離心條件為：離心加速度：14000～16000g，離心時間：8～15分鐘，離心溫度：2℃～6℃。

8.根據權利要求1所述的細胞質DNA的提取方法，其特征在于：在步驟(4)中，加入乙醇后的離心條件為：離心加速度14000～16000g，離心時間2～3分鐘，離心時溫度：2℃～6℃。