[發明專利]肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體、工程菌、制備方法及其應用

無效

• 申請號: 200810069914.8
• 申請日: 2008-07-01
• 公開（公告）號: CN101319224A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 張錫林
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12;C12N1/21;C07K14/435;C07K1/14;G01N33/53;C12R1/19
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別涉及肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體、工程菌、制備方法及其應用。

背景技術

肺吸蟲病(Paragonimiasis)是一種常見和重要的人獸共患寄生蟲病，散在流行于我國10多個省、市、自治區，致病蟲種主要為衛氏并殖吸蟲(Paragonimus?westermani)和斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimus?skrjabini)，尤其斯氏貍殖吸蟲作為僅在我國流行的一種吸蟲，其在人體內不能發育成熟，而以幼蟲在人體內移行、竄擾，常常引起游走性皮下包塊或結節，腦占位性病變和內臟損傷等肺外型寄生蟲表現，造成多器官、組織的損害。肺吸蟲病由于臨床癥狀不典型，易與其他疾病混淆，病原學檢查又難以發現蟲卵、蟲體，目前主要采用免疫學方法進行確診，但現有的免疫學方法存在一些缺陷，如診斷抗原主要為蟲體粗抗原，易與其它吸蟲出現交叉反應；無療效考核作用；各實驗室采用的診斷抗原標準不一致，無法對各實驗室的檢測結果進行比較；天然抗原的獲得日益困難等，因此，迫切需要研制新的肺吸蟲病免疫診斷抗原。

半胱氨酸蛋白酶(Cysteine?protease)是多種寄生蟲分泌、排泄的一種蛋白水解酶，也是免疫優勢抗原，并具有明顯的種、屬特異性。發明人研究發現，斯氏貍殖吸蟲的半胱氨酸蛋白酶對宿主具有免疫原性和反應性，能誘導免疫反應，可作為肺吸蟲病的免疫診斷抗原；因該蛋白酶的免疫組化反應呈現蟲體的腸道、排泄囊內，其編碼基因雜交定位在成蟲的腸壁、體壁，故將該蛋白酶又稱為肺吸蟲排泄分泌蛋白(Excretory-secretory?protein，ESP)。

由于天然肺吸蟲ESP蛋白來源有限，難以大規模生產，不能滿足臨床免疫診斷的需要，而利用分子生物學手段、技術對肺吸蟲ESP蛋白進行cDNA克隆、構建重組表達載體并誘導表達是解決此問題的一個重要方法，因此，本領域迫切需要開發能夠高效表達肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體、工程菌和制備方法。

發明內容

有鑒于此，為了能夠高效表達肺吸蟲ESP蛋白，并且表達穩定、表達產物免疫反應性高，本發明的目的之一在于提供一種肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體，含有肺吸蟲ESP蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，表達載體為pQE-80L。

本發明的目的之二在于提供一種肺吸蟲ESP蛋白的工程菌，含有所述肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體，宿主菌為大腸桿菌。

進一步，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌株。

本發明的目的之三在于提供利用所述重組表達載體制備肺吸蟲ESP蛋白的方法，包括以下步驟：

a.工程菌的構建

將所述肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體轉化入宿主菌感受態細胞，用含氨芐青霉素的LB平板進行篩選培養，獲得陽性克隆菌，即工程菌；

b.工程菌的培養

將步驟a所得工程菌接種于含氨芐青霉素的液體LB培養基中，于溫度37℃振搖過夜；

c.工程菌的誘導表達

取步驟b過夜培養菌液，按1∶100的比例接種于含氨芐青霉素的液體LB培養基中，于溫度37℃振搖培養1小時，加入異丙基硫代半乳糖苷即IPTG誘導劑至終濃度為200μmol/L，繼續培養5-6小時，收集菌液，離心，去除上清液，細菌沉淀用磷酸鹽緩沖液即PBS洗滌3次后，用5倍體積的細菌裂解液重懸，于冰浴下超聲，取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；

d.表達產物的純化

取步驟c收集的上清液，利用重組表達載體在表達蛋白氨基端引入的6個組氨酸標簽，以Ni²⁺-NTA樹脂親和層析法進行純化，即得肺吸蟲ESP蛋白，置4℃保存。

進一步，所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌；

進一步，所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌株。

本發明的目的之四在于提供利用所述重組表達載體制得的肺吸蟲ESP蛋白在制備肺吸蟲病檢測試劑或檢測裝置中的應用。

本發明的有益效果在于：本發明構建的肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體和工程菌，具有表達量高，表達穩定的優點；利用本發明的重組表達載體制備肺吸蟲ESP蛋白的方法，蛋白收率高且免疫反應性高；用制得的肺吸蟲ESP蛋白免疫動物，可制備特異性抗體，還可進一步制備肺吸蟲病檢測試劑或檢測裝置；采用肺吸蟲ESP蛋白和其多克隆抗體制得的肺吸蟲病檢測試劑盒和檢測裝置，具有高度特異、敏感性，并具有療效考核作用，可以準確、快速、簡便地進行肺吸蟲病的診斷與鑒別診斷、以及療效考核，具有重要的臨床應用價值。