[發明專利]肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體、工程菌、制備方法及其應用

無效

• 申請號: 200810069914.8
• 申請日: 2008-07-01
• 公開（公告）號: CN101319224A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 張錫林
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12;C12N1/21;C07K14/435;C07K1/14;G01N33/53;C12R1/19
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

1.制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，其特征在于,包括以下步驟：

a.工程菌的構建

將肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體轉化入宿主菌感受態細胞，用含氨芐青霉素的LB平板進行篩選培養，獲得陽性克隆菌，即工程菌；

所述肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體含有肺吸蟲排泄分泌蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；表達載體為pQE-80L；

所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌株；

b.工程菌的培養

將步驟a所得工程菌接種于含氨芐青霉素的液體LB培養基中，于溫度37℃振搖過夜；

c.工程菌的誘導表達

取步驟b過夜培養菌液，按1∶100的比例接種于含氨芐青霉素的液體LB培養基中，于溫度37℃振搖培養1小時，加入異丙基硫代半乳糖苷即IPTG誘導劑至終濃度為200μmol/L，繼續培養5-6小時，收集菌液，離心，去除上清液，細菌沉淀用磷酸鹽緩沖液即PBS洗滌3次后，用5倍體積的細菌裂解液重懸，于冰浴下超聲，取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；

d.表達產物的純化

取步驟c收集的上清液，利用重組表達載體在表達蛋白氨基端引入的6個組氨酸標簽，以Ni²⁺-NTA樹脂親和層析法進行純化，即得肺吸蟲排泄分泌蛋白，置4℃保存。