[發(fā)明專利]肺吸蟲病檢測試劑盒及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810069585.7
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101266253A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張錫林
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，特別涉及一種肺吸蟲病檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

肺吸蟲病(Paragonimiasis)是一種常見和重要的人獸共患寄生蟲病，主要流行于亞洲、非洲和拉丁美洲，尤以亞洲地區(qū)多見，在我國流行于22個省、市、自治區(qū)，估計(jì)每年感染者約200萬之多，嚴(yán)重危害人類健康，尤其是青少年、兒童的健康。

肺吸蟲病主要是肺吸蟲蟲體(幼蟲或成蟲)在人體組織與器官內(nèi)移行、寄居造成的機(jī)械性損傷，及其代謝物等引起的免疫病理反應(yīng)。在我國，致病蟲種主要為衛(wèi)氏肺吸蟲和斯氏肺吸蟲，其成蟲寄生于人、犬、果子貍等肉食動物的肌肉和器官如肝、肺中；尤其斯氏肺吸蟲作為僅在我國流行的一種吸蟲，其在人體內(nèi)不能發(fā)育成熟，而以幼蟲在人體內(nèi)移行、竄擾，常常引起游走性皮下包塊或結(jié)節(jié)，腦占位性病變和內(nèi)臟損傷等肺外型寄生蟲表現(xiàn)，造成多器官、組織的損害。肺吸蟲病根據(jù)肺吸蟲寄生部位不同，出現(xiàn)復(fù)雜的病理變化和多種多樣的臨床表現(xiàn)，臨床癥狀不典型，易與其他疾病混淆，誤診率極高。對于感染早期、低度感染及肺外型肺吸蟲病患者，以發(fā)現(xiàn)蟲卵或蟲體的病原學(xué)檢測方法往往難以獲得檢測結(jié)果，因此，肺吸蟲病的檢測和鑒別檢測在很大程度上需依賴于免疫學(xué)檢測。

目前，用于肺吸蟲病的免疫學(xué)檢測方法種類較多，包括抗體檢測方法如皮內(nèi)試驗(yàn)(IT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)、對照免疫電泳試驗(yàn)(CIEP)、免疫熒光試驗(yàn)(IFAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等；以及抗原檢測方法如多克隆或單克隆抗體ELISA法等?？贵w檢測方法敏感性高，但因治愈后抗體在體內(nèi)仍可維持較長時(shí)間，致使療效考核效果不理想，尤其在疫區(qū)反復(fù)感染人群中無法區(qū)別是現(xiàn)行感染還是既往感染；抗體檢測中使用的抗原，如蟲體抗原、排泄分泌抗原等，均為粗抗原，易出現(xiàn)同源吸蟲間交叉反應(yīng)，并嚴(yán)重依賴于蟲體來源的成分；各實(shí)驗(yàn)室的檢測抗原不一致，導(dǎo)致無法對檢測結(jié)果進(jìn)行比較等問題。此外，循環(huán)抗原(CAg)檢測，即對蟲體的代謝產(chǎn)物及腺體分泌液、子宮液、脫落的蟲體皮層表膜等抗原性物質(zhì)的檢測，方法特異性高，能反映感染蟲荷；因CAg出現(xiàn)較抗體產(chǎn)生為早，有早期檢測價(jià)值；而且經(jīng)有效治療使蟲體死亡后抗原消失快，可用于確診和(或)療效考核，但其不足之處在于敏感性較低，并受多種因素干擾。這一現(xiàn)狀嚴(yán)重影響了臨床上肺吸蟲感染的早檢測、早預(yù)防、早治療，限制了人肺吸蟲感染的流行病學(xué)調(diào)查研究。因此，篩選一種高度特異、敏感的用于肺吸蟲病的單一檢測抗原成分，并制成肺吸蟲病檢測試劑盒，準(zhǔn)確、快速、簡便地進(jìn)行肺吸蟲病的診斷與鑒別診斷、以及療效考核具有重要意義及廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，為了解決現(xiàn)有肺吸蟲病免疫學(xué)檢測方法中抗體檢測法存在的療效考核效果不理想、有交叉反應(yīng)干擾、以及無法對各實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果進(jìn)行比較等技術(shù)問題，發(fā)明人采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、雙向凝膠電泳(2-DE)、蛋白免疫印跡(Western?Blotting)、質(zhì)譜等技術(shù)對肺吸蟲的成蟲、幼蟲及囊蚴期的蟲體蛋白進(jìn)行分析，識別出蟲體排泄分泌物中能用于免疫檢測的特異性抗原，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)獲得其編碼基因片段(Genbank登錄號為AY083923)，根據(jù)所得序列推導(dǎo)的多肽由165個氨基酸組成，命名為肺吸蟲排泄分泌蛋白(Excretory-secretory?protein，ESP)，制備該蛋白并經(jīng)動物免疫制備出特異性抗體，再進(jìn)一步制得肺吸蟲病檢測試劑盒。

本發(fā)明的目的在于，提供一種肺吸蟲病檢測試劑盒，包括檢測條、樣品稀釋液，檢測抗原為肺吸蟲ESP蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

進(jìn)一步，所述檢測抗原為膠體金標(biāo)記的肺吸蟲ESP蛋白；

進(jìn)一步，所述檢測條由樣品墊1和吸收墊5順序貼附于帶背襯6的檢測層2上構(gòu)成；檢測層2上包被由抗人IgG抗體形成的檢測線3和抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體形成的質(zhì)控線4；

進(jìn)一步，所述樣品稀釋液為濃度為0.01-0.05mol/L、pH值為7.0-7.2的磷酸鹽緩沖液即PBS緩沖液，內(nèi)含濃度為5-8μg/ml的膠體金標(biāo)記的肺吸蟲ESP蛋白、質(zhì)量百分濃度為1％的牛血清白蛋白即BSA；

進(jìn)一步，所述試劑盒內(nèi)還有樣品稀釋孔。

本發(fā)明的另一目的在于，提供所述肺吸蟲病檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：