[發明專利]人源化抗CD25單鏈抗體及制備方法

有效

• 申請號: 200810066250.X
• 申請日: 2008-03-27
• 公開（公告）號: CN101544695A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 萬琳;盧曉風;程驚秋;蔡華偉;陸燕蓉;李勝富;張杰;李幼平;步宏
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司
• 代理人: 黃韌敏

技術領域

本發明涉及一種抗體，尤其涉及一種單鏈抗體。

本發明還涉及表達該單鏈抗體的表達載體和宿主細胞。

本發明還涉及該單鏈抗體的制備方法。

背景技術

CD25是IL-2受體的α亞基，在靜息T細胞上不表達或只有很低水平的表達， 在活化后的T細胞上高表達，成為活化T細胞的標志之一，因此又稱作Tac抗原 (T細胞活化抗原)[Robb?RJ，Kutny?RM.Structure-function?relationships?for?the IL-2?receptor?system.J?Immunol?1987；139：855-62]。抗CD25抗體可以通過封閉 CD25，阻斷IL-2的信號傳遞，抑制T細胞活化，例如抗CD25單抗anti-Tac可顯 著降低移植排斥發生率[Kirkman?RL，Saqiro?ME.Carpcer?CB.Transplantation. 1991；51：107～13]。此外，CD25在一些惡性血液疾病細胞上組成型高表達， 包括皮膚T淋巴細胞瘤、毛細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、霍奇金病、 成人T細胞性白血病等。在許多自身免疫性疾病中，CD25在T細胞上也過量表 達。因此，抗CD25抗體及免疫毒素對這些腫瘤及自身免疫性疾病也可能提供 有效治療[Waldmann?TA.Daclizumab(anti-Tac，Zenapax)in?the?treatment?of leukemia/lymphoma.Oncogene.2007，26，3699-3703]。

最早用于制備單抗的方法為雜交瘤法，所獲抗體為鼠源性，但臨床研究發 現其鼠源性會誘導產生中和抗體(人抗鼠抗體，HAMA)[LoBuglio?AF，Wheeler RH，Trang?J，Haynes?A，Rogers?K，Harvey?EB，et?al.Mouse/human?chimeric monoclonal?antibodies?in?man：kinetics?and?immune?response.Proc?Natl?Acad?Sci USA?1989；86：4220-4.]。為克服這一缺點，人們對anti-Tac進行了人源化改造。 1997年，美國羅氏公司生產的人源化抗CD25單克隆抗體daclizumab成為第一個 被FDA批準上市的人源化抗體，用于防治移植排斥[Tsurushita?N，Hinton?PR， Kumar?S.Design?of?humanized?antibodies?From?anti-Tac?to?Zenapax.Methods. 2005；36：69-83]。

Daclizumab由90％的人源抗體序列和10％的鼠源抗體序列構成，人源序列 源自人IgG1恒定區和Eu骨髓瘤抗體的可變框架區，鼠源序列源自鼠抗-Tac抗 體的互補決定區，從DNA序列估計其分子量為144kDa。人源化改造后的抗體 具備了以下優點：引起HAMA的幾率低，在血漿中的半衰期由鼠源抗體的40 小時延長到20天，而且通過其人源的Fc段可介導抗體依賴的細胞毒(ADCC) 反應[Morris?JC，Waldmann?TA.Advances?in?interleukin?2?receptor?targeted treatment.Ann?Rheum?Dis.2000，59(suppl?I)：i109-i114]。

單鏈抗體(single?chain?fragment?variable?antibody，scFv)是一種基因工程 抗體，通過DNA重組技術將抗體輕鏈可變區(V_L)和重鏈可變區(V_H)通過 一段連接短肽(linker)首尾連接而成，是保留完整抗原結合部位的最小功能 片段。和完整抗體相比，單鏈抗體具有以下優點：1)分子量小，大小僅為完 整抗體的六分之一，免疫原性較低；2)組織穿透力強，容易進入實體瘤周圍 的微循環；3)血液清除快，腎臟蓄積很少；4)無Fc段，非特異結合低；5) 易于通過基因工程大量生產；6)易于基因操作，更易構建重組免疫毒素。

在國內外研究中，已有基于鼠源性抗CD25單抗的scFv構建和生產報道， 但因鼠單抗可變區的存在，應用時仍可能會有HAMA產生。目前，尚沒有相關 文獻涉及用人源化抗CD25抗體daclizumab構建的scFv。