[發明專利]亞麻白粉病抗病基因分子標記

無效

• 申請號: 200810064839.6
• 申請日: 2008-07-02
• 公開（公告）號: CN101302521A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 楊學;李柱剛;關鳳芝;王珣;趙云;吳廣文;劉麗艷;趙念力;宋憲友;劉昭軍;路穎;劉琦;康慶華;張莉莉
• 申請（專利權）人: 楊學;李柱剛;關鳳芝
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12Q1/68
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技術領域

本發明屬于亞麻抗病育種和分子生物學領域，特別涉及與亞麻白粉病抗性基因相連鎖的分子標記及獲得方法，可應用于分子標記輔助育種。

背景技術

目前，白粉病是我國亞麻產區的一種常發病，是危害亞麻生產的主要病害之一，在田間發生時期短，流行速度快。近幾年來，據黑龍江、云南和新疆等地區的調查，亞麻生長后期全田大發生，很少有抗病品種，尤其是國外品種發病特別嚴重。亞麻白粉病病原菌為Oidium?Lini?Skoric(亞麻粉孢)，屬半知菌亞門真菌；有性態為Erysiphe?cichoracearum?DC.(二孢白粉菌)，屬子囊菌亞門真菌菊科白粉菌。白粉病病原菌侵染亞麻的莖、葉及花器，在其上覆蓋白粉狀薄層，導致其呼吸作用提高，蒸騰作用強度增加，光合效率降低，嚴重阻礙了其正常的生長發育，造成早枯、落葉、原莖光澤度差、麻籽結實率低、千粒重低、纖維質量差，嚴重影響了種子和纖維的產量和質量，給亞麻生產帶來了巨大的損失^[1，2，3]。目前，亞麻白粉病已經成為威脅我國亞麻生產的常見病害之一，所以對該病的防治刻不容緩。盡管實踐中可以采取化學藥劑來防治亞麻白粉病，但是，培育抗病品種是最為安全、經濟、有效的措施。

分子標記在亞麻抗病方面的研究較少，僅對亞麻抗銹病基因和抗枯萎病基因進行了標記。早在1991年，Hausner?G等就通過使用CAPS(cleavedamplified?polymorphic?sequence，酶切擴增多態性序列)標記技術成功地對亞麻抗銹病基因M3進行了標記^[4]。利用抗病基因的保守性獲得的分子標記很可能與篩選定位的新基因共分離這一特點，可以在各式基因文庫中篩選適宜的克隆。Anderson等用轉座子標記技術克隆亞麻中抗銹病(Melampsora?lini)基因M時，就使用了從L6基因衍生的DNA序列作探針^[5]。若根據已克隆抗病基因的完整序列設計引物，還可能從含新抗病基因的作物中通過PCR擴增直接克隆到該抗病基因。若在PCR引物中附加酶切點，擴增的含抗病基因的DNA序列經酶切后，可以直接克隆到質粒或M13噬菌體載體中。隨后在1999年，Hausner?G等人以RFLP標記技術為手段對亞麻抗銹病基因L2、L6、L11進行了標記^[6]。在國內，薄天岳等人也對亞麻抗銹病基因進行了分子標記，用520個10堿基隨機引物對含有亞麻抗銹病基因M4的近等基因系材料NM4及其輪回親本Bison進行RAPD分析，其中OPA18引物在NM4材料中穩定地擴增出特異的DNA片段，并將OPA18₄₃₂片段回收、克隆和測序，成功地將其轉化為SCAR標記。對不同抗源材料的擴增分析表明，該標記是M4基因的特異標記，目前這一標記已成功地應用于亞麻抗銹病基因M4的分子標記輔助選擇育種中^[7]。

目前，亞麻分子遺傳圖譜還不完善，只建立了包含13個RFLP和80個RAPD標記的連鎖群^[8]。Spielmeyer等人利用AFLP標記技術，以雙單倍體系(DH)為材料構建亞麻遺傳連鎖圖譜，并用于識別獨立連鎖組上對抗枯萎病有較大影響的兩個數量性狀基因位點(QTLs)^[9]。2003年薄天岳等人用高抗枯萎病亞麻品種“晉亞7號”與高感枯萎病品種“晉亞1號”配制雜交組合，接種鑒定其正反交F₁代以及F₂代分離群體的枯萎病發生情況，結果表明，晉亞7號對枯萎病的抗性屬于細胞核遺傳，受2個顯性基因控制。用48個EcoRI/MseI引物組合對“晉亞7號”“晉亞1號”兩個親本及其F₂代抗病和感病基因池進行AFLP分析，共擴增出約3300條可分辨的帶，其中3條為穩定的差異。用“晉亞7號”和“晉亞1號”雜交產生的F₂代分離群體對3個特異條帶與目的基因的遺傳連鎖性進行分析，發現特異條帶AG/CAG與暫定名為FuJ7(t)的抗枯萎病基因緊密連鎖，二者之間的遺傳距離為5.2cM。將AG/CAG片段回收，克隆和測序，成功地將其轉化為SCAR標記，可以更加方便地用于對FuJ7(t)基因的分子檢測和標記輔助選擇^[10]。