[發(fā)明專利]亞麻白粉病抗病基因分子標(biāo)記

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810064839.6
• 申請(qǐng)日: 2008-07-02
• 公開（公告）號(hào): CN101302521A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊學(xué);李柱剛;關(guān)鳳芝;王珣;趙云;吳廣文;劉麗艷;趙念力;宋憲友;劉昭軍;路穎;劉琦;康慶華;張莉莉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 楊學(xué);李柱剛;關(guān)鳳芝
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種亞麻白粉病抗病基因分子標(biāo)記，其特征在于：與亞麻抗白粉病基因相連鎖的分子標(biāo)記，RAPD分子標(biāo)記是用下述方法得到的：

(1)抗病基因供體親本來自于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物所抗白粉病材料9801-1，其與感病品種ILONA、VENUS、DIANE進(jìn)行正反交得到的F₁和F₂代群體，亞麻雜交后代白粉病抗性鑒定在田間進(jìn)行，在溫室內(nèi)亞麻苗上繁殖白粉病病原菌，在亞麻快速生長(zhǎng)期將病苗移到田間鑒定行間，使其分生孢子自然接種到鑒定植株上，待充分發(fā)病時(shí)觀察葉片的發(fā)病情況，調(diào)查級(jí)別分為高抗、抗、中抗、感、高感五級(jí)，調(diào)查F₂代群體抗感分離比，研究亞麻白粉病抗病基因遺傳規(guī)律，

(2)以SDS方法提取亞麻親本及自交后代幼苗DNA：

取葉片0.3g，放入1.5mL離心管中，于液氮中研磨成粉末狀并加入750μL·65℃預(yù)熱的SDS提取緩沖液，于65℃水浴中保溫20-30分鐘，取出離心管，加入5mol/L醋酸鉀250μL，冰浴20-30分鐘，而后在4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液到另一1.5mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇24∶1，在4℃下10000rpm離心10分鐘，取上清液到另一1.5mL離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，于-20℃下放置30分鐘，使DNA以沉淀析出，挑出DNA沉淀轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，用70％乙醇洗滌數(shù)次，用無水乙醇脫水，加入適量滅菌的超純水，37℃溶解，0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，

(3)采用RAPD分子標(biāo)記方法，進(jìn)行與亞麻白粉病抗性基因相關(guān)的分子標(biāo)記的篩選：

反應(yīng)體系為：PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體積為25μL，組成包括：3.5U?TaqDNA聚合酶、10×buffer?2.5μL、1mM?Mg2+、250μM?dNTPs、0.4μM?randomprimer、100ng模板DNA，PCR反應(yīng)程序，94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s、37℃復(fù)性60s、72℃延伸90s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，電泳檢測(cè)，按1∶6-6×1oading?buffer，PCR產(chǎn)物，比例把上樣液與PCR產(chǎn)物混合后點(diǎn)樣，在1.3％瓊脂糖凝膠加溴化乙錠0.5μg/mL上電泳，電泳電壓為3-4伏/厘米，保持10℃恒溫，以DL2000marker作為分子量時(shí)照，配制膠的緩沖液為1×TAE，電泳緩沖液為0.5×TAE，

(4)經(jīng)RAPD分子標(biāo)記0PP02792的連鎖性鑒定，發(fā)現(xiàn)RAPD標(biāo)記與抗白粉病基因共分離，

分別提取抗病、感病單株的總體DNA，用與前面同樣的反應(yīng)體系、引物及程序進(jìn)行單株的PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)抗、感單株標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計(jì)算交換值，用Mapmaker3.0軟件對(duì)分離群體單株的抗病性和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，計(jì)算標(biāo)記與抗白粉病基因之間的遺傳距離。