[發明專利]一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法

有效

• 申請號: 200810064831.X
• 申請日: 2008-06-30
• 公開（公告）號: CN101302535A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 平文祥;葛菁萍;凌宏志;宋剛;杜春梅;趙丹;高冬妮;曹喜生
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/54
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 單軍

技術領域

本發明涉及一種質粒載體的構建方法。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)不具備木糖代謝能力，因此無法發酵植物纖維水解液生產乙醇。目前采用代謝工程手段在釀酒酵母中人為建立木糖代謝途徑——木糖還原酶-木糖醇脫氫酶(XR-XDH)途徑或木糖異構酶(XI)途徑。但是經代謝工程改造后的釀酒酵母的木糖利用率仍然很低，而且發酵副產物木糖醇產生量高，導致乙醇得率難以提高。

發明內容

本發明的目的是為了解決目前經代謝工程改造后的釀酒酵母木糖利用率仍然很低，且發酵副產物木糖醇產生量高的問題，而提供的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法。

表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法按以下步驟進行：一、克隆質粒pKT0150中KanR基因；二、克隆釀酒酵母XKS1基因；三、克隆質粒pKT0150中ADH1終止子片段；四、克隆釀酒酵母中2.2kb?rDNA片段；五、回收、純化步驟一至四制備的基因片段，然后再分別與pGEMT?Easy載體在16℃的條件下連接10～12h，得到pGMT-KanR、pGMT-XKS1、pGMT-ADH1T和pGMT-rDNA；六、構建質粒pR，以釀酒酵母整合載體p406ADH1為骨架引入有抗性標記的基因KanR；七、構建質粒pRK，將XKS1基因加入質粒pR；八、構建質粒pRKT，將ADH1終止子片段加入質粒pRK；九、將2.2kb?rDNA片段加入質粒pRKT，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒；其中步驟一中擴增上游引物序列為5’-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列為5’-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步驟二中擴增上游引物序列為5’-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3’，下游引物序列為5’-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3’；步驟三中擴增上游引物序列為5’-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3’，下游引物序列為5’-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3’；步驟四中擴增上游引物序列為5’-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3’，下游引物序列為5’-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。

木酮糖激酶(xylulokinase，XK)能夠催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖，是木糖代謝的限速步驟之一，處于木糖代謝物進入磷酸戊糖途徑(PPP)的節點位置。雖然釀酒酵母自身具有木酮糖代謝的下游酶系，但由于其活性較低限制了木糖代謝流向磷酸戊糖途徑(PPP)，從而導致經代謝工程改造后的釀酒酵母的木糖利用率依然較低，發酵副產物木糖醇產生量高，乙醇得率仍較低。

釀酒酵母內源性超表達木酮糖激酶基因XKS1可以加速木糖代謝流，提高釀酒酵母的木糖利用率和乙醇得率。本發明方法構建了一種攜帶有木酮糖激酶基因XKS1的、適合于釀酒酵母工業菌株的多拷貝整合表達載體，該載體可以將超表達木酮糖激酶基因XKS1高拷貝整合到釀酒酵母的染色體基因組上，從而實現了木酮糖激酶XKS1的超量穩定表達，疏通了釀酒酵母利用木糖產乙醇的木糖代謝流，提高了木糖的利用率，降低了副產物木糖醇的產量。將本發明方法構建的質粒轉入釀酒酵母中，對比發酵試驗證明轉入本發明方法構建質粒的釀酒酵母的乙醇得率比經代謝工程改造后的釀酒酵母的乙醇得率高30％以上，說明本發明方法構建的質粒轉入釀酒酵母后可以消除木糖轉化乙醇代謝途徑上的限制，提高了下游酶系的活性。

具體實施方式