[發明專利]一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法

有效

• 申請號: 200810064831.X
• 申請日: 2008-06-30
• 公開（公告）號: CN101302535A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 平文祥;葛菁萍;凌宏志;宋剛;杜春梅;趙丹;高冬妮;曹喜生
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/54
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 單軍

1.一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法按以下步驟進行：一、克隆質粒pKT0150中KanR基因；二、克隆釀酒酵母XKS1基因；三、克隆質粒pKT0150中ADH1終止子片段；四、克隆釀酒酵母中2.2kb?rDNA片段；五、回收、純化步驟一至四制備的基因片段，然后再分別與pGEMT?Easy載體在16℃的條件下連接10～12h，得到pGMT-KanR、pGMT-XKS1、pGMT-ADH1T和pGMT-rDNA；六、構建質粒pR，以釀酒酵母整合載體p406ADH1為骨架引入有抗性標記的基因KanR；七、構建質粒pRK，將XKS1基因加入質粒pR；八、構建質粒pRKT，將ADH1終止子片段加入質粒pRK；九、將2.2kb?rDNA片段加入質粒pRKT，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒；其中步驟一中擴增上游引物序列為5’-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列為5’-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步驟二中擴增上游引物序列為5’-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3’，下游引物序列為5’-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3’；步驟三中擴增上游引物序列為5’-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3’，下游引物序列為5’-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3’；步驟四中擴增上游引物序列為5’-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3’，下游引物序列為5’-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’，步驟六中用限制性內切酶Nde?I和Aat?II對p406ADH1和pGMT-KanR分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pR，步驟七中用限制性內切酶Spe?I和SalI對質粒pR和pGMT-XKS1分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質粒pRK，步驟八中用限制性內切酶Sal?I和Eag?I對質粒pRK和pGMT-ADH1T分別進行雙酶切，然后用T4?DNA連接酶進行連接，得到質粒pRKT，步驟九中用限制性內切酶Nde?I、Eag?I對質粒pRKT和pGMT-rDNA分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，即得到表達木酮糖激酶基因的質粒。

2.根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟六中的抗性標記為G418。

3.根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟一中PCR反應體系為10μL，由1μL10×PCR?buffer、0.8μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μL濃度為1pmol/μL的上游引物、1μL濃度為1pmol/μL的下游引物、0.8μL濃度為25mmol/L的MgCl₂、2μL質粒pKT0150、0.2μL濃度為5U/mL的Taq酶和余量的重蒸餾水組成；PCR反應條件：預變性94℃2min，變性94℃1min，退火45℃1min，延伸72℃2min，共30個循環，延伸72℃7min。

4.根據權利要求1所述的一種表達木酮糖激酶基因的質粒的構建方法，其特征在于步驟二中PCR反應體系為10μL，由1μL10×PCR?buffer、0.8μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μL濃度為1pmol/μL的上游引物、1μL濃度為1pmol/μL的下游引物、0.8μL濃度為25mmol/L的MgCl₂、2μL釀酒酵母基因組DNA、0.2μL濃度為5U/mL的Taq酶和余量的重蒸餾水組成；PCR反應條件：預變性94℃5min，變性94℃1min，退火55℃1min，延伸72℃2min，共30個循環，延伸72℃10min。