[發明專利]紫杉醇基因組重排菌株HDFS4－26及紫杉醇高產菌株的選育方法

無效

• 申請號: 200810064048.3
• 申請日: 2008-02-29
• 公開（公告）號: CN101280281A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 周東坡;趙凱;平文祥;張麗娜;劉軍;林燕
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/04;C12P17/02;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 單軍

技術領域

本發明涉及一種紫杉醇基因組重排菌株及紫杉醇工程菌株的選育方法。

背景技術

惡性腫瘤嚴重地威脅著人類的健康，而且癌癥是目前人類疾病中僅次于心腦血管疾患的第二大死因。

紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取出來的具有多種抗腫瘤療效的二萜生物堿類藥物(分子式如圖1所示)。由于紅豆杉(又名紫杉)是珍稀樹種，生長速度緩慢，并且其生物學特性對生態環境要求較高，天然更新能力差，所以種群數量極為有限，屬瀕危保護植物，資源十分有限，因此國內外學者都在積極地研究開發紫杉醇的新藥源。

微生物發酵生產是降低成本、大量獲取紫杉醇的最理想方法。1993年美國蒙塔那州立大學化學家Andrea?Stierle和植物病理學家Gary?Strobel在蒙塔那西北部國家冰川公園的短葉紅豆杉中分離到一株內生真菌Taxomycesandreanae，在Stierle等的工作一經發表，美國細胞克隆公司就出價100萬美元支持蒙塔那州立大學的這項研究。但是目前可用于紫杉醇微生物發酵的菌株的紫杉醇產量仍然較低(菌株HD_100-23系菌株NCEU-1的孢子經UV和NTG復合誘變后獲得的高產紫杉醇的突變株，其杉醇產量為356.80μg/L，菌株UV_40-19和UL_50-6系菌株NCEU-1的原生質體分別經紫外線和紫外線與氯化鋰復合誘變后獲得的高產紫杉醇的突變株，紫杉醇產量分別為376.38μg/L和392.63μg/L)，難以滿足市場的需求。

發明內容

本發明的目的是為了解決目前可用于紫杉醇微生物發酵的菌株的紫杉醇產量仍然較低的問題，而提供的紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26及紫杉醇高產菌株的選育方法。

本發明紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26為樹狀多節孢(Nodulisporiumsylviforme)屬于多節孢屬(Nodulisporium)，保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢大學，保藏日期為2008年2月28日，保藏號為CCTCC?M?208026；紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌落培養初期為白色，后期為深灰褐色，背面為黑色；紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌絲部分內生，部分表生，有隔，多分支，菌絲為深褐色向頂性逐漸變淺，直徑為2.24～5.86μm，未見到菌核產生；分生孢子梗單生，多數呈樹狀分支，褐色向頂性變淡，長37～162μm；產孢細胞柱狀，單生或輪狀排列，6.37～22.63μm×2.51～3.86μm，合軸式產孢；分生孢子單生，橢圓形或卵圓形，平滑或具小疣，無隔膜，5.07～7.89μm×2.45～3.79μm，分生孢子在產孢細胞的產孢點位置呈頭狀排列。

本發明紫杉醇高產菌株按以下方法選育：一、原生質體制備；二、原生質體的滅活；三、原生質體的融合；四、原生質體再生；五、基因組重排、篩選，即得到紫杉醇高產菌株；其中用于原生質體制備的菌株為紫杉醇產生菌HD_100-23、UV_40-19和UL_50-6。

本發明紫杉醇高產菌株的選育方法中步驟一原生質體制備：取活化的紫杉醇產生菌HD_100-23、UV_40-19和UL_50-6放入PDA液體培養基中在28±0.5℃的條件下靜置培養3天，菌懸液在4000g條件下離心10min收集菌絲體，再用旋渦混合器將菌絲體振蕩均勻，然后用滲透壓穩定劑洗滌2次，之后按每250mg菌絲體加入1mL酶裂解液的比例加入酶裂解液，再置于30℃環境中溫浴7h，然后用3層無菌鏡頭紙過濾，濾液4000g在4000g條件下離心10min，原生質沉淀再用滲透壓穩定劑洗滌2次得到純化的原生質體，之后將原生質體懸浮于滲透壓穩定劑中。

步驟二原生質體的滅活：

將純化后的HD_100-23原生質體懸液移入無菌試管中，50℃恒溫水浴5min進行熱滅活；

將純化后的UV_40-19的原生質體懸液移入直徑為6cm的無菌平皿中，置于已預熱穩定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射100s進行紫外線滅活；

向純化后的UL_50-6的原生質體懸液中加入終濃度為0.6％LiCl，然后立即置于已預熱穩定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射70s進行紫外線+氯化鋰復合滅活。