[發明專利]紫杉醇基因組重排菌株HDFS4－26及紫杉醇高產菌株的選育方法

無效

• 申請號: 200810064048.3
• 申請日: 2008-02-29
• 公開（公告）號: CN101280281A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 周東坡;趙凱;平文祥;張麗娜;劉軍;林燕
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/04;C12P17/02;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 單軍

1、紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26，其特征在于紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26為樹狀多節孢(Nodulisporium?sylviforme)屬于多節孢屬(Nodulisporium)，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2008年2月28日，保藏號為CCTCC?M?208026；紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌落培養初期為白色，后期為深灰褐色，背面為黑色；紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌絲部分內生，部分表生，有隔，多分支，菌絲為深褐色向頂性逐漸變淺，直徑為2.24～5.86μm，未見到菌核產生；分生孢子梗單生，多數呈樹狀分支，褐色向頂性變淡，長37～162μm；產孢細胞柱狀，單生或輪狀排列，6.37～22.63μm×2.51～3.86μm，合軸式產孢；分生孢子單生，橢圓形或卵圓形，平滑或具小疣，無隔膜，5.07～7.89μm×2.45～3.79μm，分生孢子在產孢細胞的產孢點位置呈頭狀排列。

2、根據權利要求1所述的紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26，其特征在于紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26在25～28℃、PDA培養基上培養3天，菌落平展，菌落直徑為4.1～5.8cm。

3、紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于紫杉醇高產菌株按以下方法選育：一、原生質體制備；二、原生質體的滅活；三、原生質體的融合；四、原生質體再生；五、基因組重排、篩選，即得到紫杉醇高產菌株；其中用于原生質體制備的菌株為紫杉醇產生菌HD_100-23、UV_40-19和UL_50-6。

4、根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟一原生質體制備：取活化的紫杉醇產生菌HD_100-23、UV_40-19和UL_50-6放入PDA液體培養基中在28±0.5℃的條件下靜置培養3天，菌懸液在4000g條件下離心10min收集菌絲體，再用旋渦混合器將菌絲體振蕩均勻，然后用滲透壓穩定劑洗滌2次，之后按每250mg菌絲體加入1mL酶裂解液的比例加入酶裂解液，再置于30℃環境中溫浴7h，然后用3層無菌鏡頭紙過濾，濾液4000g在4000g條件下離心10min，原生質沉淀再用滲透壓穩定劑洗滌2次得到純化的原生質體，之后將原生質體懸浮于滲透壓穩定劑中。

5、根據權利要求4所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于原生質體懸浮于滲透壓穩定劑中，原生質體的濃度為1.0×10⁷cfu/mL。

6、根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟二原生質體的滅活：

將純化后的HD_100-23原生質體懸液移入無菌試管中，50℃恒溫水浴5min進行熱滅活；

將純化后的UV_40-19的原生質體懸液移入直徑為6cm的無菌平皿中，置于已預熱穩定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射100s進行紫外線滅活；

向純化后的UL_50-6的原生質體懸液中加入終濃度為0.6％LiCl，然后立即置于已預熱穩定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射70s進行紫外線+氯化鋰復合滅活。

7、根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟三原生質體的融合：從滅活原生質體懸液中各取1mL懸液進行兩兩混合，混合液在3000r/min的條件下離心10min，去除離心上清液后將原生質體懸浮于0.2mL滲透壓穩定劑中，再加入1.8mL、溫度為30℃、質量濃度為35％的PEG融合劑，在30℃條件下水浴保溫90s，再加入5mL、溫度為4℃的滲透壓穩定劑終止融合，然后離心洗滌去除融合劑，經過融合的原生質體再重新懸浮于滲透壓穩定劑中；其中融合劑中添加有濃度為0.01mol/L的CaCl₂。

8、根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟四原生質體再生采用雙層平板培養法：將步驟三經過融合的原生質體懸液倍比稀釋，稀釋液各吸取0.5mL與4.5mL?PDA再生半固體培養基混勻，然后傾注于PDA再生固體培養基平板上，放入28℃的環境中培養3～5天。