[發明專利]克力托辛的制備方法及在抗腫瘤藥物中的應用

無效

• 申請號: 200810063437.4
• 申請日: 2008-08-05
• 公開（公告）號: CN101333236A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 劉非燕;任剛;傅承新;吳平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07H19/067
• 分類號: C07H19/067;A61K31/7064;A61K36/06;A61P35/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域，具體地說是從天然菌物中提取有效成分及其用途，尤其是從大白樁菇菌(Leucopaxillus?giganteus)子實體中提取有效成分clitocine的方法、其在制備抗腫瘤藥物中的應用及相關機理。

背景技術

大白樁菇菌(Leucopaxillus?giganteus)屬白蘑科，夏秋季于草原上單生或群生，有時生于林中草地上。分布于河北、內蒙古、吉林、遼寧、山西、黑龍江、青海、新疆等地。該菌在治療腫瘤方面的研究報道很少。惡性腫瘤是當今威脅人類身心健康最嚴重的疾病，死亡率高，目前尚無治愈率較高的藥物報道，因此研制抗惡性腫瘤的藥物，長期以來是人們努力的方向。

發明內容

本發明的一個目的是提供克力托辛(clitocine)的制備方法，該clitocine的分子式為C₉H₁₃N₅O₆，分子量287，屬于嘌呤核苷類，其特征是通過以下步驟實現，將原料新鮮大白樁菇菌子實體(2.7kg)真空冷凍干燥，粉碎機粉碎，所得340g菌粉浸于1.5L?95％(v/v)酒精中，其間更換新鮮溶劑一次，合并兩次浸提液，減壓濃縮得酒精浸膏(25.7g)。浸膏經乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏(15.7g)。取15g乙酸乙酯浸膏上硅膠柱，CH₂Cl₂/MeOH(10∶0-0∶10)梯度洗脫，收集細胞篩選有活性的洗脫峰(6.5g)，然后上反相柱RP-18(ODS，50μm，Φ25×420mm)，MeOH/H₂O(1∶9)洗脫，細胞篩選有活性的部分再經過反相柱RP-C₈制備[5μm；Φ20×250mm；MeOH/H₂O(5∶95)；8ml/min]，得到目的化合物clitocine(815mg)。

本發明的另一個目的是提供clitocine單味制劑或與藥用敷料組合，可在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明所制備的clitocine，可在制備治療乳腺癌藥物、制備治療宮頸癌藥物、制備治療肝癌藥物、制備治療胃癌等抗癌藥物中的應用，本發明還提供了其治療肝癌時凋亡方面的相關機制。

本發明提供的藥物，其制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、軟膠丸、軟膠囊、滴丸劑或注射劑。

本發明提供的藥物，制劑的給藥形式主要包括口服給藥或注射給藥。

實驗證明本發明提供的clitocine，具有體外強烈抑制腫瘤細胞增殖的作用，經四甲基偶氮唑鹽(簡稱MTT法)檢測，對乳腺癌Bcap37的半數增殖抑制濃度IC₅₀為11μM，對乳腺癌MCF-7的IC₅₀為43μM，對宮頸癌Hela的IC₅₀為15μM，對胃癌SGC-7901的IC₅₀為2μM，對肝癌SMMC-7721的IC₅₀為1μM，對肝癌HepG2的IC₅₀為0.24μM；裸小鼠體內實驗表明，3mg/kg劑量的clitocine對人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤有顯著的生長抑制作用，抑瘤率達40.1％；在此基礎上，我們還對其中肝癌HepG2細胞進行了抗腫瘤機制的深入研究，一系列相關實驗證明誘導凋亡是clitocine體外抑制HepG2增殖的機制之一，進一步證明該凋亡過程是通過線粒體通路和死亡受體通路完成的，并且clitocine還影響HepG2的細胞周期，將其阻滯在G2/M期。因此clitocine作為單味制劑或與藥物敷料組合，均可在制備治療惡性腫瘤藥物中應用。本發明為進一步開發新型抗惡性腫瘤藥物提供了先導化合物和科學依據，對利用我國真菌資源具有重要意義。

附圖說明

圖1為clitocine的液相色譜分析。

圖2為不同濃度clitocine對乳腺癌Bcap37、肝癌SMMC-7721、胃癌SGC-7901、乳腺癌MCF-7，宮頸癌Hela五株腫瘤細胞體外增殖抑制率折線圖。

圖3為不同濃度clitocine對肝癌HepG2細胞在24h、48h和72h的體外增殖抑制率折線圖。

圖4為不同濃度clitocine殺傷肝癌SMMC-7721細胞的顯微圖。

圖5為不同濃度clitocine作用于肝癌HepG2細胞產生DNA梯狀條帶的凝膠電泳圖。

圖6為clitocine作用于肝癌HepG2細胞的AnnexinV-PI雙染凋亡圖。