[發(fā)明專利]L-氨基酸衍生物的生物催化制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810062997.8
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101423861A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張子張;郭紅纓
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué);杭州慧根藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P13/04;C12P13/22;C12R1/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于化合物的制備方法，一種通過生物催化清除消旋體中D-型異構(gòu)體制備高對映體純的L-氨基酸的方法，主要涉及L-苯丙氨酸的衍生物的生物催化制備方法。?

背景技術(shù)

非蛋白氨基酸，如高純度含不同取代基的L-氨基酸衍生物，是現(xiàn)代新藥研發(fā)的重要工具和基礎(chǔ)原料。結(jié)構(gòu)多樣的非蛋白氨基酸在世界市場上一直價格昂貴，供不應(yīng)求。非蛋白氨基酸等的制備能力也是一個國家新藥研發(fā)能力的象征性指標，與發(fā)達國家相比，我國在該領(lǐng)域落后的差距較大。由于產(chǎn)品附加值高，進入市場容易，非蛋白氨基酸制造技術(shù)的發(fā)展競爭激烈。現(xiàn)行方法有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。前者用不對稱催化劑，價格昂貴且回收難，過程中尚有保護去保護等步驟；后者有海因法，水解酶拆分法等，但每種方法都需要多步反應(yīng)，工藝復(fù)雜，路線長，排放物種類多等弊端。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡單的高純度L-氨基酸的生物催化制備方法，通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：用細菌活細胞做催化劑。?

在500ml搖瓶中，放置100ml培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉汁瓊脂：蛋白胨10克，牛肉提取物3克，瓊脂15克，NaCl?5克，蒸餾水1000毫升)，接種細菌Aeromonas?sp.(氣單胞菌)，生長24小時后，離心，傾出清液，置回搖瓶中，每瓶中加入相同量消旋體D，L-氨基酸50mg；調(diào)pH7.3，通空氣，透氣封口，放回在控溫搖床中，圓周式搖動，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間4-40小時，期間通過不定期采樣，超濾、稀釋，注入HPLC進行分析追蹤轉(zhuǎn)化進程，用大賽路冠醚手性色譜柱分析，分析時間控制在到120分鐘，找到消旋體底物的兩個等比信號峰(分布在15-60分鐘，見實例色譜圖)。實施中，通過HPLC上消旋體底物的兩個峰中D型峰的消耗跟蹤反應(yīng)進程，當D的信號超出檢測靈敏限度后，停止生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)混合物經(jīng)離心收取清液，通過離子交換樹脂柱分離，得到L型氨基酸衍生物。本發(fā)明所用的微生物菌株為氣單胞菌，送交中國微?生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?No.2226。?

本發(fā)明的有益之處是：(1)含多種酶的細菌Aeromonas?sp.(氣單胞菌)(CGMCC?2226)活細胞，在通空氣的條件下，能夠選擇性地氧化消旋體氨基酸中D-型異構(gòu)體，留下未反應(yīng)的L-型。這一方法可用于高純度L-型氨基酸的制備，也可以用于L-氨基酸中D-摻雜物的清除。(2)本發(fā)明方法無需傳統(tǒng)方法中常用的先保護、再去保護的衍生步驟，可直接將消旋體中D-型氨基酸選擇性地轉(zhuǎn)化，留下未反應(yīng)的高純度的L-氨基酸。(3)本發(fā)明方法，路線簡短，效率高，可控制產(chǎn)物的對映體純度。(4)本發(fā)明方法也可用于其他類L型非蛋白氨基酸衍生物的制備。(5)本發(fā)明方法，制備過程不用金屬催化劑、有機溶劑及助劑，反應(yīng)在中性條件進行，除可再生的生物質(zhì)外，無化學(xué)排放，屬綠色環(huán)保生產(chǎn)過程。(6)本發(fā)明方法設(shè)計合理，資源節(jié)省，步驟簡單。?

附圖說明

圖1(A，B，C)苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖2(A，B，C)4-氟苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖3(A，B，C)2-氯苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖4(A，B，C)4-氯苯丙氨酸混合物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖5(A，B，C)2，4-二氯苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖6(A，B，C)3，4-二氯苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖7(A，B，C)2-溴苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖8(A，B，C)4-溴苯丙氨酸混合物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖9(A，B，C)4-甲基苯丙氨酸混合物生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖10(A，B，C)4-硝基苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

圖11(A，B，C)酪氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時間下反應(yīng)混合物的色譜圖。?

具體實施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。?

實施例1??高純度L-苯丙氨酸衍生物的制備(以苯丙氨酸為例)?