[發明專利]一種弓形蟲感染早期檢測的方法

無效

• 申請號: 200810062836.9
• 申請日: 2008-06-30
• 公開（公告）號: CN101315381A
• 公開（公告）日: 2008-12-03
• 發明（設計）人: 譚峰;潘長旺;沙丹;李麗寧
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/53
• 代理公司: 溫州甌越專利代理有限公司
• 代理人: 李友福

技術領域

本發明涉及一種專性細胞內寄生的機會致病性原蟲的檢測方法，具體地說是涉及弓形蟲感染早期檢測的方法。

背景技術

弓形蟲(Toxoplasma?gondii)是一種專性細胞內寄生的機會致病性原蟲，它在人和動物的有核細胞內寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形蟲病。弓形蟲病呈世界性分布，人類弓形蟲的平均感染率達33％。健康成人感染后一般都不會出現明顯的臨床癥狀，但卻會在體內持續很多年。當機體免疫力降低或嚴重感染時，這種隱性感染則可表現出顯著的弓形蟲病癥狀，如弓形蟲眼病、弓形蟲肝炎、弓形蟲淋巴結炎等。免疫功能低下或嚴重缺損的機體(如AIDS、先天性丙種球蛋白缺乏癥、多發性骨髓瘤及其它惡性腫瘤患者)，弓形蟲感染常常呈致死性病變。弓形蟲位列孕婦宮內感染致胚胎畸形的五大病原體(TORCH)之首，感染的孕婦除自身患病外，平均約40％可通過胎盤將弓形蟲傳染給胎兒，造成流產、死胎、畸形或嬰兒先天性弓形蟲病。胎兒受損程度與胎齡呈負相關，感染發生的越早，胎兒受損程度會越嚴重，目前還尚未有弓形蟲病早期診斷的有效方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足而提供一種弓形蟲的早期診斷方法。

為達到上述目的，本發明公開了一種弓形蟲感染早期檢測的方法，所述弓形蟲感染早期檢測的方法由以下步驟組成：

1)用碳酸緩沖液稀釋純化后的NTPase-II制成5μg/ml的包被液，100μl/孔包被96孔酶標板，4℃包被過夜；

2)PBST洗板3-5次，2-3min/次，拍干；

3)加5％的脫脂奶粉，37℃封閉2h；

4)PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；

5)加入稀釋度為1∶100的被檢血清，100μl/孔，37℃孵育1.5h；

6)PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；

7)加入稀釋度為1∶4000的羊抗鼠酶標二抗IgM，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；

8)加入底物顯色液A液和B液，37℃避光顯色10-15min，加終止液，50μl/孔；

9)酶標儀讀數，450nm處空氣調零后測OD值，以陰性血清的OD_450nm平均值和3倍標準差之和作為陰性血清的上限，當血清的OD_450nm≥X+3S者即判斷為陽性血清，反之則為陰性。

本發明的弓形蟲感染早期檢測的方法還可以由以下步驟組成：

1)用碳酸緩沖液稀釋純化后的NTPase-II制成5μg/ml的包被液，100μl/孔包被96孔酶標板，4℃包被過夜；

2)PBST洗板3次，2-3min/次，拍干；

3)加5％的脫脂奶粉，37℃封閉2h；

4)PBST洗板5次，2-3min/次，拍干；

5)加入稀釋度為1∶200的被檢血清，100μl/孔，37℃孵育1.5h；

6)PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；

7)加入稀釋度為1∶4?000的羊抗鼠酶標二抗IgG，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板7次，2-3min/次，拍干；

8)加入底物顯色液A液和B液，37℃避光顯色10-15min，加終止液，50μl/孔；

9)酶標儀讀數，450nm處空氣調零后測OD值，以陰性血清的OD_450nm平均值和3倍標準差之和作為陰性血清的上限，當血清的OD_450nm≥X+3S者即判斷為陽性血清，反之則為陰性。

由于NTPase-II(三磷酸核苷水解酶-II?nucleosidetriphosphate?hydrolase)是弓形蟲可以在宿主體內寄生的關鍵性酶，也是弓形蟲急性感染階段引起機體產生免疫反應的主要抗原，因此利用弓形蟲融合蛋白NTPase-II對弓形蟲病的早期診斷具有較高的準確性。

下面將結合具體實施例對本發明作進一步說明。

具體實施方式

下面為NTPase-II(nucleoside?triphosphate?hydrolase，即弓形蟲融合蛋白三磷酸核苷水解酶-II)在弓形蟲病早期診斷中的應用具體實施例。

實施例1

本檢測方法中弓形蟲的融合蛋白NTPase-II的制備方法包括以下步驟：

(1)弓形蟲基因組DNA的制備；

(2)弓形蟲NTPase-II基因的擴增；