[發(fā)明專利]線性聚N－異丙基丙烯酰胺協(xié)助溶菌酶體外復(fù)性的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810062428.3
• 申請(qǐng)日: 2008-06-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101298610A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 關(guān)怡新;陳瑩瑩;葛翔;姚善涇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/36
• 分類號(hào): C12N9/36
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張法高

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種線性聚N-異丙基丙烯酰胺協(xié)助溶菌酶體外復(fù)性的方法。

背景技術(shù)

基因工程蛋白質(zhì)產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中往往面臨這樣一個(gè)難題：重組表達(dá)產(chǎn)物通常是以沒(méi)有生物活性的聚集體形式即包涵體存在的。如何使蛋白質(zhì)高效地重折疊成為具有天然構(gòu)象和天然活性的蛋白質(zhì)，是決定該基因工程蛋白質(zhì)能否產(chǎn)業(yè)化和為人類所利用的關(guān)鍵，這就使得對(duì)于蛋白質(zhì)體外復(fù)性技術(shù)的開(kāi)發(fā)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。但由于蛋白質(zhì)的多樣性、結(jié)構(gòu)和折疊過(guò)程的復(fù)雜性，使得人們不能對(duì)一種復(fù)性方法進(jìn)行簡(jiǎn)單的移植，也很難找到具有普適性而又低成本的高效復(fù)性方法。因此實(shí)際操作過(guò)程中必須針對(duì)每種目標(biāo)蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，對(duì)影響復(fù)性的各個(gè)因素逐一優(yōu)化，才能最終確定適用于該種蛋白質(zhì)的復(fù)性方法。

至今，蛋白質(zhì)復(fù)性方法中的許多問(wèn)題依然困擾著我們，如蛋白質(zhì)活性回收率低、復(fù)性起始和終了的蛋白質(zhì)濃度偏低等。目前出現(xiàn)的一些能夠?qū)Ω邼舛鹊鞍踪|(zhì)進(jìn)行高效復(fù)性的方法如色譜復(fù)性等，往往因?yàn)樵O(shè)備及材料投入成本高而影響了大規(guī)模應(yīng)用；分子伴侶和折疊酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程是受體內(nèi)復(fù)性過(guò)程的啟發(fā)，能夠在一定程度上提高復(fù)性收率，但分子伴侶和折疊酶易失活，一般僅用于復(fù)性機(jī)理的研究。常規(guī)的能夠協(xié)助蛋白質(zhì)復(fù)性的添加劑如聚乙二醇、L-精氨酸、去污劑和表面活性劑以及人工分子伴侶等，雖然對(duì)設(shè)備要求不高，但協(xié)助復(fù)性效果有限。在這種情況下，開(kāi)發(fā)出一種新型、高效、易于分離回收而又低成本的蛋白質(zhì)體外復(fù)性添加劑就顯得尤為重要。近年來(lái)功能高聚物作為一種新型的協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性的添加劑越來(lái)越引起人們的重視，其主要優(yōu)點(diǎn)在于影響復(fù)性的參數(shù)較少、操作方便、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單且生產(chǎn)成本較低。

Roy等(參見(jiàn)Protein?Engineering，Design?&?Selection，2003，16，1153-1157)采用了商品化的聚合物Eudragit?S-100來(lái)復(fù)性α-胰凝乳蛋白酶。該聚合物是pH敏感型聚合物，由甲基丙烯酸與甲基丙烯酸甲酯以1∶2的摩爾比共聚而成。當(dāng)溶液pH呈弱酸性時(shí)(pH4.8)，Eudragit?S-100就從溶液中沉淀出來(lái)，而當(dāng)pH升高到6.0左右時(shí)，該聚合物又再次溶解。用Eudragit?S-100來(lái)復(fù)性α-胰凝乳蛋白酶時(shí)，復(fù)性緩沖液pH8.2，聚合物處于溶解狀態(tài)，通過(guò)它的羧酸酯基與變性α-胰凝乳蛋白酶疏水基團(tuán)之間的疏水相互作用會(huì)阻止蛋白質(zhì)聚集，從而協(xié)助蛋白復(fù)性，除了可以提高復(fù)性活力回收率之外，Eudragit?S-100還大大提高了復(fù)性速率，變性α-胰凝乳蛋白酶在10min便可完全恢復(fù)酶活力。但該聚合物是pH敏感型的，而不同的蛋白質(zhì)保持活力的環(huán)境pH差異較大，因此，該聚合物所能復(fù)性的蛋白質(zhì)種類很有限。Shimizu等(參見(jiàn)Colloids?and?Surfaces?B：Biointerfaces，2002，18，137-144)采用反相懸浮法合成了Poly(styrene-co-glycidyl?metharrylate)(SG)微球，再通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在微球體表面接枝上巰基或二硫鍵等功能基團(tuán)，可以使處于去折疊態(tài)疏水基團(tuán)大量外露的變性目標(biāo)蛋白質(zhì)方便地吸附到微球體表面，在抑制蛋白質(zhì)相互聚集沉淀的同時(shí)，隨著二硫鍵的正確配對(duì)而緩慢折疊。通過(guò)該方法可以使溶菌酶的復(fù)性收率在稀釋復(fù)性的基礎(chǔ)上提高40％。但是該法制備步驟較繁瑣，且得到的微球僅限于協(xié)助含有較多巰基或二硫鍵的蛋白質(zhì)體外復(fù)性。本課題組曾合成粒狀聚N-異丙基丙烯酰胺并考察了其協(xié)助溶菌酶復(fù)性的效果(參見(jiàn)溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法，發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枺篫L?2004?1?0073406.9，授權(quán)日：2006年8月2日)，該聚合物是一種交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)狀凝膠，在水中可以顯著溶脹，但不能溶解，由于粒狀凝膠表面會(huì)吸附部分蛋白，從而造成蛋白損失。本發(fā)明采用的聚N-異丙基丙烯酰胺是一種線性溫敏型聚合物，其低臨界溶解溫度在32℃附近。一方面，線性聚N-異丙基丙烯酰胺具有疏水基團(tuán)異丙基，可以通過(guò)疏水相互作用來(lái)協(xié)助蛋白質(zhì)復(fù)性；另一方面，聚N-異丙基丙烯酰胺還含有親水基團(tuán)酰胺基團(tuán)，能夠在復(fù)性液中溶解，分散性優(yōu)于粒狀聚合物凝膠，可以與變性蛋白質(zhì)更好地接觸。線性聚N-異丙基丙烯酰胺疏水作用的強(qiáng)弱可以通過(guò)控制溫度來(lái)方便地調(diào)節(jié)，以滿足不同的目標(biāo)蛋白的復(fù)性要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種線性聚N-異丙基丙烯酰胺協(xié)助溶菌酶體外復(fù)性的方法。

方法的步驟如下：