[發明專利]人二相代謝酶的三個功能性突變體及構建和用途

無效

• 申請號: 200810061634.2
• 申請日: 2008-05-20
• 公開（公告）號: CN101323846A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 曾蘇;袁玲敏;陳靜
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/866;C12N15/70;C12N15/81;C12Q1/48
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，更具體的說是涉及用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統得到人二相代謝酶UGT2B7的三個功能性突變體基因，含有該突變基因的重組粘粒，用該載體轉染昆蟲細胞得到突變體重組酶。

背景技術

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶UGTs是位于內質網膜上的糖蛋白，能催化一系列內源性和外源性親脂糖苷配基底物(如膽紅素，甾體激素，藥物，殺蟲劑等)，使之葡萄糖醛酸化。根據氨基酸序列的同源性，可以將尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶UGTs分為兩大家族：UGT1A和UGT2B。UGT2B7屬于UGT2B亞族，其基因含有6個外顯子，總長16kb，其中第1個外顯子和第2個外顯子編碼底物結合區域(SBD)。從第3個外顯子到第6個外顯子編碼UDP葡醛酸結合位點。UGT2B7不僅催化內源物如甾體激素類(雄甾酮和雌三醇)，膽酸和維生素A，同樣也催化臨床上廣泛運用的非甾體激素抗炎藥(如萘普生，酮洛芬，布洛芬)，以及丙戊酸鈉，普萘洛爾和AZT，同時也是唯一催化嗎啡類的二相代謝酶。

與其他基因類似，UGT2B7基因也存在單核苷酸多態性(SNP)。特別是802C＞T，在外顯子2處發生錯義，結果在268位的氨基酸由組氨酸(H)變為酪氨酸(Y)，這個位點在SBD區。這個序列的突變在UGT2B7的多態性研究中有重要意義^[1，2，3]。據報道^[4]，UGT2B7*2(H268Y，802C＞T)T/T基因型在中國人群中的分布頻率為9.2％，比Caucasian(25.3％)分布低得多(p＝0.00018)，但是與日本人群的分布無顯著性差異(p＝0.17)。與健康對照組相比，T/T基因型在癌癥患者中的比率更高(25％∶9％，p＝0.03)。與同樣暴露在苯肼下的健康人相比，膀胱癌患者的T/T基因型比率更高。Coffman等^[5]研究發現UGT2B7*2代謝Normorphine(去甲嗎啡)和Naltriben(δ2受體拮抗劑)，而UGT2B7*1不代謝。UGT2B7*2對Buprenorphine(丁丙諾啡)的代謝是UGT2B7*1的10倍。Sawyer^[2]等研究發現UGT2B7*2比UGT2B7*1顯示了更高的嗎啡-6-O-葡醛酸/嗎啡比率。

最近，又有報道211G＞T(位于外顯子1區)，編碼的蛋白由內氨酸(A)突變為絲氨酸(S)，此突變點位于SBD區域，這個突變體可能會影響底物結合的特異性。Katsuhiko等^[6]報道UGT2B7*71S(71A＞S，211G＞T)在日本人群中的分布頻率為18.40％。

研究者也發現了位于外顯子5區的突變點1192G＞A，野生型編碼的蛋白D398是位于UDP葡醛酸結合的后半位置，這個酸性氨基酸殘基在哺乳動物中是高度保守的，從酸性氨基酸天冬氨酸(D)突變為中性氨基酸天氨酰氨(N)可能會影響UDP-葡萄糖醛酸化的結合^[3]。

上述研究表明，UGT2B7基因多態性的存在可能潛在地使藥物相互作用的情況更加復雜化，因為包含有等位基因突變的病人可能表現為葡萄糖醛酸化活性的增強或減弱，對于不同個體用藥時會表現出不同的藥效/藥動(PK/PD)行為^[7，8]。因此，利用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統體外構建和表達功能性突變體重組酶，并以此為工具有助于研究UGT2B7等位基因多態性所產生的藥物代謝情況的差異，有助于預測個體化用藥可能產生的副作用，并對實行個體化合理用藥有特別重要的指導意義，除此之外，也能在分子水平上更好地研究酶與底物藥物的構效關系。

發明內容

本發明的目的是提供利用PCR定點突變技術和桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統獲得的人二相代謝酶(UGT2B7)的三個功能性突變體重組酶UGT2B7*71S(A71S，211G＞T)，UGT2B7*2(H268Y，802C＞T)和UGT2B7*5(D398N，1192G＞A)。SEQ?IDNO：1為UGT2B7*71S(A71S，211G＞T)的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQID?NO：2為UGT2B7*2(H268Y，802C＞T)的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQ?IDNO：3為UGT2B7*5(D398N，1192G＞A)的核苷酸序列和氨基酸序列。