[發明專利]人二相代謝酶的三個功能性突變體及構建和用途

無效

• 申請號: 200810061634.2
• 申請日: 2008-05-20
• 公開（公告）號: CN101323846A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 曾蘇;袁玲敏;陳靜
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/866;C12N15/70;C12N15/81;C12Q1/48
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶，其特征是：所述三個功能性突變體重組酶分別是UGT2B7*71S、UGT2B7*2和UGT2B7*5，其中SEQ?IDNO：1為UGT2B7*71S的核苷酸序列和氨基酸序列，SEQ?ID?NO：2為UGT2B7*2的核苷酸序列和氨基酸序列，SEQ?ID?NO：3為UGT2B7*5的核苷酸序列和氨基酸序列。

2.根據權利要求1所述的人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶的構建方法，是在引物中導入突變位點，以帶有人UGT2B7的野生型基因的質粒為模板，經PCR反應、磷酸化、自身連接和轉化，分別合成帶有UGT2B7的三個功能性突變體重組酶基因的質粒，其特征是通過以下步驟實現：

(1)野生型基因的獲得：

按照GENEBANK中的人UGT2B7基因合成引物，上下游引物分別引入SalI和XhoI位點和保護堿基，以人肝組織為模板，通過TRIZOL試劑提取總RNA，通過RT-PCR，并在終止密碼子前添加6-His標簽，得到PCR產物后，與pGEM載體相連接獲得pGEM-UGT2B7重組質粒，并用pGEM通用引物對重組質粒進行測序，經過DNASTAR軟件與genebank中NM?001074序列進行比對，證明已獲得序列完全正確的UGT2B7的基因克隆，SEQ?ID?NO：4為UGT2B7的核苷酸序列和氨基酸序列；

(2)野生型質粒模板的提取：將已測序驗證正確的pGEM-UGT2B7重組質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞中得重組菌落，將重組菌落在瓊脂培養板上進行劃板，然后挑取瓊脂培養板上的單菌落，接種至2ml～5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養液中，37℃振搖過夜，取1.5ml培養物倒入1.5ml離心管中，12?000g離心15秒，棄上清回收菌體，根據試劑說明書加入100μl溶液I，充分懸浮細胞，加入100μl溶液II，上下顛倒5～6次，使細菌裂解，室溫放置1分鐘，加入430μl溶液III，顛倒5～10次，使之充分中和，室溫放置2分鐘，12000rpm高速離心2～5分鐘，吸取上清至套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中，8000rpm室溫離心1分鐘，棄廢液，將UNIQ-10柱放回2ml收集管中，吸取500μl洗滌溶液到UNIQ-10柱，10000rpm室溫離心30秒，重復一次，棄廢液，將UNIQ-10柱放回2ml收集管中，10000rpm室溫離心15秒，棄廢液，將UNIQ-10柱放入一干凈的1.5ml離心管中，加50μl溶解液至膜中央，室溫放置2分鐘，10000rpm室溫離心1分鐘；

(3)引物的合成：針對人藥物二相代謝酶UGT2B7的基因合成了3對引物，每對引物含有突變位點，合成后溶于滅菌水中，-20℃保存備用，

突變位點???????????????????????引物

UGT2B7*71S(A71S，211G＞T)??????SEQ?ID?NO.7：aac?tca?tcc?(t)ct?ctt?aaa?att

???????????????????????????????SEQ?ID?NO.8：gtt?ggg?atc?aaa?aag?aat?gga?ag

UGT2B7*2(H268Y，802C＞T)???????SEQ?ID?NO.9：cag?ttt?cc(t)(c)at?cca?ctc?tta?cc

???????????????????????????????SEQ?ID?NO.10：aaa?att?cca?gga?gtt?tgg?aat?aag?cca?tac?g

UGT2B7*5(D398N，1192G＞A)??????SEQ?ID?NO.11：cca?ttg?ttt?gcc?(a)at?caa?cct?gat?aac?att?gc

???????????????????????????????SEQ?ID?NO.12：aat?ccc?cac?cat?agg?gat?ccc?atg?gta?gat?tgc

(4)利用PCR定點突變技術，引入突變位點，然后經過磷酸化、自身連接和轉化等步驟后分別獲得人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因UGT2B7*71S，UGT2B7*2和UGT2B7*5，

PCR反應體系：10×Pyrobest?Buffer?5μl、dNTP?Mixture(各2.5mmol/L)4μl、Primer?1(20μmol/L)1μl、Primer?2(20μmol/L)1μl、Template?0.01～1ng、PyrobestDNA?Polymerase(5U/μl)0.25μl、ddH₂0?up?to?50μl，

反應條件：

94℃?30秒、55～60℃?30秒、72℃?5分鐘、1～3步循環30次，Hold?on?8℃；

(5)將人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因UGT2B7*71S，UGT2B7*2和UGT2B7*5與pFastBac載體相連接后，轉化入大腸桿菌DH10Bac感受態細胞中發生轉座作用，獲得重組粘粒Bacmid-UGT2B7*71S，Bacmid-UGT2B7*2和Bacmid-UGT2B7*5；

(6)將重組粘粒Bacmid-UGT2B7*71S，Bacmid-UGT2B7*2和Bacmid-UGT2B7*5分別感染昆蟲細胞，從而獲得各自的第一代病毒液，然后擴增病毒液使其病毒滴度至10⁷～10⁸pfu/ml，從而表達重組酶，觀察細胞的形態變化，在72小時后收集細胞，超聲破碎獲得三個功能性突變體重組酶UGT2B7*71S，UGT2B7*2和UGT2B7*5。