[發(fā)明專利]細胞色素P450 BM－3 D168S變體酶以及應(yīng)用其制備靛玉紅的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810061399.9
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101333521A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梅樂和;胡升;虞青;黃俊
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12P17/16
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 周烽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程中的基因工程領(lǐng)域和生物制藥領(lǐng)域，具體地說是涉及具有新的催化性質(zhì)的細胞色素P450BM-3D168W突變酶、其基因及這種酶在生物催化中的用途，特別是在靛玉紅制備中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

靛玉紅是我國科學家上世紀經(jīng)過多年研究從傳統(tǒng)藥方當歸龍薈丸中發(fā)現(xiàn)的一種新型的白血病治療藥物。上世紀六十年代中期，中國醫(yī)學科學院血液病研究所在慢性粒細胞性白血病的治療研究中發(fā)現(xiàn)當歸龍薈丸具有較好的療效，經(jīng)過中國醫(yī)學科學院血液病研究所與成都中醫(yī)學院等多家機構(gòu)對該丸劑中11種成分歷時10多年的藥理分析，其中的青黛最終被確定為抗白血病的有效組分。經(jīng)過進一步的研究，從青黛中分離得到的靛玉紅被確認為確切的抗白血病成分并在臨床試驗中得到驗證。采用靛玉紅治療慢性白血病具有起效快、療效顯著，劑量小，副作用小等優(yōu)點，特別是靛玉紅對機體免疫功能無抑制、對機體正常的造血功能無明顯影響，顯著優(yōu)于馬利蘭等傳統(tǒng)化療藥物，目前靛玉紅已成為治療慢性白血病的臨床用藥。靛玉紅的發(fā)現(xiàn)及其在慢性白血病治療中的成功應(yīng)用是我國科學家在白血病治療領(lǐng)域應(yīng)用傳統(tǒng)中藥遺產(chǎn)做出的卓越貢獻。

隨著對靛玉紅治療機理研究的進一步深入，國內(nèi)外科學家發(fā)現(xiàn)靛玉紅及其衍生物除了用于白血病治療外還能用于多種癌癥的治療。研究發(fā)現(xiàn)：靛玉紅能抑制細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)，從而抑制細胞增殖；靛玉紅及其衍生物可結(jié)合在一些重要細胞周期調(diào)節(jié)子的ATP結(jié)合位點上，對實驗性實體瘤具有廣譜抑制作用；某些靛玉紅衍生物可誘導包括人乳腺癌細胞和前列腺癌細胞在內(nèi)的腫瘤細胞凋亡。尤其引人注目的是靛玉紅對CDK的抑制具有廣譜性，即它對一個家族的蛋白激酶都具有抑制活力，而這些激酶恰好是某些特定腫瘤中出現(xiàn)異常的激酶。英國牛津大學分子生物物理實驗室的Jane?Endicott教授認為，這種特異地同時對一定數(shù)量靶點起作用的化合物對癌癥治療具有重要價值，因為如今已逐漸認識到單靶點治療癌癥的作用有限，因為癌細胞常常能逃避單一靶點的抑制。靛玉紅及其衍生物的這種相對廣譜的選擇性激酶抑制特性使它們成為了未來極具潛力的抗癌藥物。

除白血病和癌癥治療外，靛玉紅在其他疾病治療方面也極具價值。我國曾開展了利用靛玉紅治療銀屑病的研究并取得了較好的治療效果；英國阿伯丁大學的研究人員正研發(fā)能專一抑制瘧原蟲的靛玉紅衍生物。

靛玉紅作為一種從傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)的具有多種治療用途的物質(zhì)，已成為一種高附加值的天然產(chǎn)物，目前國內(nèi)報價為6-8萬人民幣/公斤。這一方面是因為國際、國內(nèi)市場對其需求量很大，另一方面也與靛玉紅在天然植物中的含量很低有關(guān)。現(xiàn)在可用于靛玉紅提取的中藥材有大青葉、板藍根多種，但即使在靛玉紅含量最高的大青葉中，靛玉紅相對于大青葉干重的含量也僅為0.03％左右；《中國藥典》2005版中就規(guī)定大青葉干燥品中靛玉紅含量不少于0.02％即為合格。這不僅使得靛玉紅生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品價格昂貴，而且生產(chǎn)過程還會消耗大量的有機溶劑和能源，造成環(huán)境負擔。此外，由于天然藥材資源有限，如果原料藥材大量從自然界獲取將破壞生態(tài)平衡；如果采用人工種植，又會產(chǎn)生與糧爭地的問題。

雖然靛玉紅也可以通過化學合成生產(chǎn)，但目前青睞天然產(chǎn)物的潮流和化學合成產(chǎn)物的復雜性使得天然靛玉紅更受重視和歡迎。

為了克服從天然植物植物中提取靛玉紅的諸多不足，人們提出了其他的獲得天然靛玉紅的方式。隨著可持續(xù)發(fā)展觀念和環(huán)保法規(guī)的強化，在節(jié)能減排的大趨勢下，目前人們已嘗試采用生物技術(shù)、通過生物催化與轉(zhuǎn)化的方法來獲得天然靛玉紅。

一種途徑是采用組織工程手段對蓼藍進行發(fā)根組織培養(yǎng)，期望通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化提高靛玉紅的含量、并結(jié)合工業(yè)化的生產(chǎn)方式降低生產(chǎn)成本。但是要使蓼藍中的靛玉紅含量發(fā)生顯著地提高并非易事，兼之組織培養(yǎng)的復雜性，這種方法目前僅有學術(shù)研究的文獻報道，尚未實用化。

另一種方法是利用能催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅的酶來生產(chǎn)靛玉紅。中國專利00810918.4披露了一種能催化吲哚羥基化的P450BM-3酶，并主張了利用表達該酶的微生物進行靛玉紅制備的權(quán)利要求。但是，該專利披露的酶在催化吲哚時主要產(chǎn)物為靛玉紅的結(jié)構(gòu)類似物靛藍，而“靛玉紅的產(chǎn)量遠低于靛藍的產(chǎn)量”，產(chǎn)物顏色為藍色；該酶催化吲哚的產(chǎn)物中，靛玉紅產(chǎn)量是如此之少，以至在“確定動力學參數(shù)時，靛玉紅的形成被忽略”。因此要利用該專利披露的酶進行靛玉紅的制備、生產(chǎn)在事實上是不可行的。

要真正利用P450BM-3酶進行靛玉紅的微生物制備，首先就要改變酶催化吲哚的反應(yīng)性質(zhì)，使靛玉紅成為主要產(chǎn)物。只有獲得了滿足需要的酶才可能真正實現(xiàn)靛玉紅的微生物或酶法制備、生產(chǎn)。