[發明專利]細胞色素P450 BM－3 D168S變體酶以及應用其制備靛玉紅的方法

無效

• 申請號: 200810061399.9
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101333521A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 梅樂和;胡升;虞青;黃俊
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12P17/16
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 周烽

1.一種細胞色素P450?BM-3?D168W變體酶，其特征在于，其基因序列為SEQ?IDNo.1的序列。

2.一種應用權利要求1所述的細胞色素P450?BM-3?D168W變體酶制備靛玉紅的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)設計細胞色素P450?BM-3單加氧酶第168位密碼子的隨機引物，以攜帶P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)變體酶基因的質粒pET28α(+)-P450?BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)為模板，進行PCR擴增；

(2)構建突變文庫；

(3)篩選催化吲哚的產物中以靛玉紅為主的突變體，獲得基因序列為SEQ?IDNO.1的P450?BM-3?D168W變體酶；

(4)構建表達細胞色素P450?BM-3?D168W變體酶的基因工程菌；

(5)基因工程菌表達細胞色素P450?BM-3?D168W變體酶；

(6)用表達細胞色素P450?BM-3?D168W變體酶的基因工程菌全細胞催化吲哚；

(7)分離催化產物，獲得靛玉紅粗品；

(8)精制靛玉紅。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述隨機引物包括上游引物5’-CAGCTTTTACCGANNNCAGCCTCATCC-3’和下游引物5’-GGATGAGGCTGNNNTTGGTAAAAGCTG-3’。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，將所述步驟(1)的PCR產物用DpnI酶解2-5小時后，轉化到大腸桿菌，轉化液再涂布到含有30μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養得到突變文庫。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)具體為：稱取表達后的基因工程菌，將其懸浮于Tris-HCl緩沖液中，緩沖液pH值為7.0～9.5，加入吲哚的二甲基亞砜溶液，吲哚終濃度范圍為0.5～2mmol/L，在180r/min、30℃搖床進行反應；反應過程中監測吲哚濃度變化，當吲哚濃度低于0.5mmol/L時，補加吲哚，直至吲哚濃度不再減少。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述緩沖液pH值為8.5，吲哚終濃度為1.5mmol/L。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，采用固定化細胞方法進行催化。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，采用微膠囊包埋方法進行催化。?