[發明專利]胎盤間充質干細胞分離和體外擴增培養方法

無效

• 申請號: 200810061267.6
• 申請日: 2008-03-20
• 公開（公告）號: CN101270349A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發明（設計）人: 王金福;袁文佶;石東燕
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;G01N33/53
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

所屬技術領域

本發明屬生物技術，涉及一種胎盤間充質干細胞分離和體外擴增培養的方法。這種方法能有效地純化胎盤間充質干細胞和提高其體外的擴增能力。

背景技術

人足月胎盤中存在一種具有多分化潛能的間充質干細胞。相關的研究已經表明這種干細胞可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和神經細胞等。這種干細胞被稱為胎盤間充質干細胞(MSCs)，將在醫學上具有細胞移植和組織工程化的重大利用價值。

由于目前還尚未發現胎盤間充質干細胞專一的特異性標記分子，因此該干細胞的分離純化采用的還是間接的方法：傳統的方法是采用灌流方法通過臍血管沖出胎盤殘留血液后，在分離血液中單個核細胞、并進行貼附培養的基礎上，利用間充質干細胞的貼附性在細胞培養瓶內貼壁形成紡錘形的成纖維狀細胞，并經過傳代貼壁來逐步純化間充質干細胞。另一類方法是剪切胎盤組織，并用膠原酶或胰酶消化組織后收集分散細胞，再行貼附培養方法進行間充質干細胞分離和純化。這兩種方法簡單方便，但是這種方法分離的細胞實質是多種細胞的混合物，而非克隆化的間充質干細胞。這種多細胞混合物的繼代培養和擴增能力較低，難以形成真正的間充質干細胞株系。雖然目前尚不清楚胎盤間充質干細胞的特異性標記分子，但公認為其表現為CD31^-、CD34^-、CD45^-、CD29⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD166⁺。根據這些特點，如果能在細胞原代貼附培養、積聚一定的細胞數量基礎上，再利用特異的抗體標記免疫磁珠進行分選，則能有效地提高胎盤間充質干細胞的純化率。

在胎盤間充質干細胞的體外培養和擴增方面，目前一般采用的是含有一定比例(如10-20％等)血清(如胎牛血清等)的培養基(如DMEM-LG等)進行貼壁培養擴增，也有人使用成纖維細胞生長因子(FGF-2)等促進胎盤間充質干細胞的增殖。但是，考慮到將來胎盤間充質干細胞在臨床移植應用的需要，采用無血清培養基以及臨床級細胞生長因子具有重要的實際應用意義。

發明內容

為了有效提高胎盤間充質干細胞的體外純化率和擴增能力，本發明的目的是提供一種胎盤間充質干細胞分離和體外擴增培養方法，通過以下方案實現：

取胎盤母體側蛻膜，剪碎后用0.1％IV型膠原酶消化并收集細胞，以DMEM(Dulbeco′s?Modified?Eagle?Medium)培養基(含10％胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，杭州)和2mML-谷氨酰胺(Sigma，上海)進行貼壁培養，再行負、正向免疫分選結合的方法純化胎盤間充質干細胞，獲得CD34^-CD105⁺細胞，在無血清體外培養體系中繼代擴增培養。

本發明對貼壁培養后收獲的胎盤間充質干細胞第一步行負向純化，即進行陰性免疫篩選。所用的陰性免疫篩選是采用CD34標記磁珠(MACS，MiltenyiBiotech?Inc.，上海)分選，獲得CD34^-細胞。

本發明對再次貼壁培養后收獲的胎盤間充質干細胞第二步行正向純化，即進行陽性免疫篩選。所用的陽性免疫篩選是采用CD105標記磁珠(MACS，Miltenyi?Biotech?Inc.，上海)分選，獲得CD34^-CD?105⁺細胞。

本發明所述的無血清體外培養體系，含有無血清培養基和成纖維細胞生長因子-2(FGF-2，Sigma，上海)，其中無血清培養基含有DMEM/F12(Dulbeco′s?Modified?Eagle?Media/Nutrient?Mixture?F-12)培養液(GIBCO，上海)、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇和非必需氨基酸(Sigma，上海)，其組成比例為DMEM/F12培養液∶1mML-谷氨酰胺∶0.1mMβ-巰基乙醇∶1％非必需氨基酸。無血清培養基與FGF-2比例為無血清培養基：5ng/mlFGF-2。

本發明的另一個目的是提供所述方法在胎盤間充質干細胞分離和體外擴增培養中應用。

本發明的有益效果是：

(1)本發明提供的技術中采用收集胎盤母體側蛻膜組織細胞后，先進行原代細胞的貼壁擴增，然后再行抗體標記免疫磁珠分選，這樣每次只需少量原代細胞(1×10⁵個細胞)就可以達到比較好的分選效果。