[發明專利]一種檢測弓形蟲的半巢式PCR方法

有效

• 申請號: 200810061232.2
• 申請日: 2008-03-18
• 公開（公告）號: CN101245367A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 杜愛芳;曲道峰;孔得翔
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及檢測弓形蟲的半巢式PCR方法。?

背景技術

弓形蟲是細胞內寄生的原生動物，所導致的弓形蟲病是一個世界性的公共衛生難題。在我國，豬肉是人們的主要肉食來源之一，而食入含有弓形蟲的豬肉是人類感染弓形蟲的主要途徑。目前，弓形蟲的檢測主要依靠血清學、病原形態鑒定或小鼠腹腔接種可疑病料等方法。但是這些方法都有不足之處，如血清學方法要求有足夠的血清滴度或病原，小鼠接種要求有新鮮的病料，所需時間較長。而PCR檢測方法只需要有病原的核酸存在就可以確診，可以快速、敏感、特異地診斷弓形蟲病。弓形蟲速殖子至少含1000種以上的蛋白質，但蟲體表面主要蛋白只有5～7種，分子量范圍在14～60kDa之間，最主要者為30kDa(P30)，弓形蟲表面蛋白中研究最多的也是P30。P30基因的ORF有1011個bp，編碼336個氨基酸，其中1-70個氨基酸為信號肽序列，其余為成熟蛋白序列。P30氨基酸序列含有大量的半胱氨酸(Cys)，提示由二硫鍵維系形成一個緊密的二級結構。本技術根據GenBank公布的P30基因序列設計三條引物，建立一種檢測弓形蟲的半巢式PCR方法。?

發明內容

本發明提供一種檢測弓形蟲的半巢式PCR方法，通過以下技術方案實現：?

(1)設置PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括：PCR管、陽性對照、陰性對照、Taq?DNA聚合酶、GoldView?DNA染料、溴酚藍上樣緩沖液(常規濃度)；(2)提取被檢樣品DNA；(3)半巢式PCR擴增；(4)擴增產物分析；?

其中步驟(1)的PCR管內含10×緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物1、引物2、引物3和MgCl₂，所述引物1，引物2和引物3分別是按下述堿基序列由DNA合成儀合成的DNA片段：?

引物1?5’-GCGTGCGGAAGGACCCACTACAAT-3’?

引物2?5’-GACTCGGCTGGAAATGC-3’?

引物3?5’-GCAAGCCACAGCGGAACAACTCAG-3’；?

所述陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，通過以下方法構建：將擴?增產物克隆至pUCm-T轉化DH5-α感受態細胞，經酶切鑒定及測序后獲得陽性重組質粒，該質粒含弓形蟲226bp基因片段；?

所述陰性對照為雙重蒸餾水；?

其中步驟(2)所述提取被檢樣品DNA，是取200μl無菌抗凝血液(或用2g樣品置研缽內，加入生理鹽水2ml，研磨成糊狀，轉移至離心管中)，Trizol試劑裂解后常規的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，4℃保存備用；?

其中步驟(3)所述的半巢式PCR擴增是在PCR檢測試劑管中加入步驟(2)處理后的DNA樣品，同樣設陰性對照和陽性對照，在25μl反應體系中加入：?

滅菌超純水????????????15.37μl?

10×PCR?buffer????????2.5μl反應循環條件：94℃?4min→94℃?1min，62℃?30sec，72℃?50sec，30個循環→72℃8min→94℃?1min，55℃?30sec，72℃?40sec，30個循環→72℃8min；?

2.5mmol/L?dNTP????????2μl?

P1????????????????????1μl?

P2????????????????????1μl?

P3????????????????????1μl?

Taq酶?????????????????0.13μl?

DNA模板???????????????2μl?

反應循環條件：94℃4min→94℃1min，62℃30sec，72℃50sec，30個循環→72℃8min→94℃1min，55℃30sec，72℃40sec，30個循環→72℃8min；?

其中步驟(4)所述擴增產物分析，是將PCR產物進行瓊脂糖電泳，被檢樣品孔出現的電泳帶與陽性對照和陰性對照比對，以判定樣品為弓形蟲感染陽性或陰性。?