[發明專利]一種檢測弓形蟲的半巢式PCR方法

有效

• 申請號: 200810061232.2
• 申請日: 2008-03-18
• 公開（公告）號: CN101245367A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 杜愛芳;曲道峰;孔得翔
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種不用于診斷目的檢測弓形蟲的半巢式PCR方法，通過以下技術方 案實現：(1)設置PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括：PCR管、陽性對照、陰 性對照、Taq?DNA聚合酶、GoldView?DNA染料、溴酚藍上樣緩沖液；(2)提 取被檢樣品DNA；(3)半巢式PCR擴增；(4)擴增產物分析；

其中步驟(1)的PCR管內含10×緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物1、 引物2、引物3和MgCl2，所述引物1，引物2和引物3分別是按下述堿基序 列由DNA合成儀合成的DNA片段：

引物15’-GCGTGCGGAAGGACCCACTACAAT-3’

引物25’-GACTCGGCTGGAAATGC-3’

引物35’-GCAAGCCACAGCGGAACAACTCAG-3’；

所述陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，通過以下方法構建：將擴 增產物克隆至pUCm-T轉化DH5-α感受態細胞，經酶切鑒定及測序后獲得陽性 重組質粒，該質粒含弓形蟲226bp基因片段；

所述陰性對照為雙重蒸餾水；

其中步驟(2)所述提取被檢樣品DNA，是取200μl無菌抗凝血液，Trizol 試劑裂解后常規的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羥甲基氨基甲烷-乙二 胺四乙酸溶解，4℃保存備用；

其中步驟(3)所述的半巢式PCR擴增是在PCR檢測試劑管中加入步驟(2) 處理后的DNA樣品，同樣設陰性對照和陽性對照，在25μl反應體系中加入：

反應循環條件：94℃4min→94℃1min，62℃30sec，72℃50sec，30個循環→72℃ 8min→94℃1min，55℃30sec，72℃40sec，30個循環→72℃8min；

其中步驟(4)所述擴增產物分析，是將PCR產物進行瓊脂糖電泳，被檢 樣品孔出現的電泳帶與陽性對照和陰性對照比對，以判定樣品為弓形蟲DNA 陽性或陰性。

2.根據權利要求1所述的一種檢測弓形蟲的半巢式PCR方法在樣品中檢 測弓形蟲DNA中的應用，其不用于診斷目的。