[發明專利]重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發酵與純化工藝

有效

• 申請號: 200810061168.8
• 申請日: 2008-03-13
• 公開（公告）號: CN101275144A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 孟凡國;夏勇;王天文;胡衛江;周海夢
• 申請（專利權）人: 浙江清華長三角研究院;嘉興博泰生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/70;C12N9/08;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司
• 代理人: 翁霽明

技術領域

本發明涉及的是一種重組耐高溫超氧化物岐化酶的工程菌構建方法及高密度發酵和純化工藝，屬于基因工程制藥技術領域。

背景技術

超氧化物岐化酶(Superoxide?Dismutase，以下簡稱SOD)是一種廣泛存在于生物體內的金屬酶；根據其所結合金屬離子的不同依次命名為Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD和Ni-SOD。SOD是氧自由基的高效清除劑，同時具有抗腫瘤，抗疲勞，抗病及抗衰老等作用；該酶在食品、化妝品和醫藥等領域中都有重要應用。

目前，主要是通過從動物血液或植物組織中提取的方法獲得SOD，因此SOD的產量在很大程度上受原材料的限制。許多研究者也曾對通過基因工程方法生產SOD進行了很多的探索，但現有方法仍存在如下問題：1)重組表達的SOD多是以無活性的包涵體形式存在，必須在純化過程中增加變性和復性等步驟，因此，難以保證SOD的收率；2)所產SOD存在著活力低，熱耐受性差，容易失活等問題，需要進行化學修飾后才能使用；3)重組表達量比較低，一般在20-40％的水平。

發明內容

本發明的目的是針對國內現有技術存在的不足，而提供一種能表達耐熱超氧化物岐化酶的工程菌構建方法及高密度發酵和純化工藝。

本發明所述的超氧化物岐化酶的工程菌構建方法，它包括：以嗜熱菌中編碼SOD的基因為模板，設計帶有限制性酶切位點的特異引物擴增目的基因，經雙酶切后連接于經相同酶切處理后的質粒載體pET28a中，構建重組質粒，命名為pSOD。然后經化學轉化法將質粒pSOD轉化至感受態大腸桿菌BL21(DE3)，經篩選，獲得高產SOD的菌株，完成SOD工程菌的構建。

所述的克隆載體和表達載體用的是同一種質粒-pET28a；用BL21(DE3)作為表達菌株。

本發明克隆了一種嗜熱菌的SOD基因序列，并且成功構建了高效表達菌株。本發明涉及的SOD工程菌的構建及其表達方法，與現有技術相比具有以下優點：(1)克隆獲得的SOD基因包含了SOD的整個結構基因。(2)構建得到的SOD工程菌表達產生的SOD具有良好熱穩定性與耐熱性。(3)表達產物占全菌蛋白的60％以上，且全部為可溶性蛋白，避免了包含體復性過程的種種麻煩。

本發明所述的超氧化物岐化酶工程菌的高密度發酵工藝：發酵過程經過一級種子培養、二級種子培養、上罐發酵、誘導表達四個步驟，最終獲得發酵產物-SOD。本發酵方法可以實現SOD的高效表達，目的蛋白的表達量占菌體蛋白總量的60％以上。

作為本發明的一種改進：發酵基本培養基按照如下表1進行配制；

表1高密度發酵基本培養基