[發明專利]一種晚香玉病毒的離體繁殖方法

無效

• 申請號: 200810060542.2
• 申請日: 2008-03-27
• 公開（公告）號: CN101250503A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: 陳劍平;徐剛;汪一婷;呂永平;牟豪杰;鄭紅英;林林
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司
• 代理人: 陳繼亮

技術領域

本發明涉及植物病毒的離體繁殖技術領域，尤其涉及一種晚香玉病毒的離體繁殖方法。

背景技術

晚香玉(Polianthes?tuberosa?L.)原本是在墨西哥和南美野生的一種石蒜科的植物，現在世界各地均有栽培，它的切花和精油具有很高的經濟價值。自從300年多前傳入中國后，目前已經成為重要的觀賞植物，尤其是在臺灣。晚香玉病毒病發生很能普遍，病毒在晚香玉植株體內的存在，使得晚香玉植株生長緩慢，植株的每株花序數、座花率降低、花期縮短、花小、花色淡，商品價值大大降低。

浙江省農業科學院從杭州晚香玉上發現輕斑駁的癥狀，電鏡觀察顯示，病汁液中具有大量線狀病毒粒子，并在植物細胞中聚集成束，伴有大量風輪狀內含體，表明受馬鈴薯Y病毒屬成員侵染。該病毒能摩擦接種侵染晚香玉，但不侵染普通煙，白肋煙、心葉煙、三先煙、蔓倫蘿、豇豆、莧色藜、昆諾藜、番茄、千日紅、豌豆和假酸漿等14種常用接種植物。測定該病毒基因組核苷酸序列，分析表明它具有典型的馬鈴薯Y病毒屬成員基因組結構特征，與已報道的臺灣晚香玉輕花葉病毒(Tuberose?mild?mosaic?virus，TuMMV)最相似。用該杭州分離物原核表達的外殼蛋白所制備的抗血清進行Western?blot分析，表明該杭州分離物與TuMMV血清學相關。根據ICTV馬鈴薯Y病毒屬成員分類標準，杭州晚香玉病毒分離物應當為馬鈴薯Y病毒屬的一個新成員，命名為晚香玉輕斑駁病毒(Tuberose?mild?mottle?virus，TuMMoV)。在福建晚香玉樣品上發現一種呈輕微花葉癥狀的馬鈴薯Y病毒屬成員，序列分析表明與臺灣已報道TuMMV所編碼的CP氨基酸序列同源性為96.5％，從而將該病毒鑒定為TuMMV。這2種病毒單獨或復合侵染是引起晚香玉種質嚴重退化的重要原因之一(林林、鄭紅英、張巧艷、陳炯、陳劍平，中國晚香玉上發現的一個馬鈴薯Y病毒屬新成員，浙江省農業科學院第十二屆青年學術論文報告會論文集，2003，P13～19)。

植物病毒的繁殖和純種毒源的保存，是植物病毒檢疫技術基礎研究工作中必不可少的重要環節。進行引種時種子、種苗及繁殖材料的病毒的檢疫時，發現了病毒病的可疑癥狀，而沒有能力把它及時地截獲下來，就談不上對病毒進行定性的檢疫。即使用血清學方法或分子生物學方法檢測一下，出現了陽性反應，而沒有獲得該毒源的保存樣品，其檢疫結果同樣是不可靠的。在植物病毒病的基礎研究工作中，傳統的繁殖毒源和保存毒源的方法是非常繁瑣的。要想繁殖一種毒源或者要保存這種毒源，一般要經過下列步驟，繁殖該病毒的鑒別寄主—把某種病毒接種到該寄主上—分離病毒—純化病毒—通過血清學檢測。電鏡觀察后認可的病毒轉接到表現系統侵染癥狀的繁殖寄主上繁殖。若要長久保存某種病毒，則需要反復地繁殖寄主，反復地轉接，以免在寄主老化死亡時病毒丟失。就繁殖寄主來說，在使用半個月至兩個月前就要播種，整個過程周期太長，若準備工作做得不及時，沒等新的寄主長到可接種時，保存毒源的老寄主就已經老化死亡，以前必須一薦接一薦地播種，連續不斷地繁殖寄主，反復地轉接。不僅耗費了大量的勞動力，還占用了大量的溫室空間。我們的研究表明晚香玉輕斑駁病毒(Tuberose?mild?mottle?virus，TuMMoV)和晚香玉輕花葉病毒(Tuberose?mildmosaic?virus，TuMMV)能摩擦接種侵染晚香玉，但不侵染普通煙，白肋煙、心葉煙、三先煙、蔓倫蘿、豇豆、莧色藜、昆諾藜、番茄、千日紅、豌豆和假酸漿等14種常用接種植物。因此，迫切需要選擇一種更佳的晚香玉病毒繁殖方法。

發明內容

本發明要解決上述現有技術的缺陷，提供一種晚香玉病毒的離體繁殖方法。

本發明目的通過以下技術方案來實現：這種晚香玉病毒的離體繁殖方法，按如下步驟進行：

1)、培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為：

(1)基本培養基：誘導、增殖及生長培養基用MS培養基；生根培養基用1/2MS培養基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～6.0；

(2)誘導培養基：MS+BA?1.0～3.0mg/L和IAA?1.0～3.0mg/L；

(3)增殖培養基：MS+BA?0.5～2.0mg/L和IAA?0.5～2.0mg/L；

(4)生長培養基：MS+BA?0.1～1.0mg/L和IAA?0.1～1.0mg/L；

(5)生根培養基：1/2MS+IBA?0.5～2mg/L和IAA?0.1～0.5mg/L；