[發明專利]一種晚香玉病毒的離體繁殖方法

無效

• 申請號: 200810060542.2
• 申請日: 2008-03-27
• 公開（公告）號: CN101250503A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: 陳劍平;徐剛;汪一婷;呂永平;牟豪杰;鄭紅英;林林
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司
• 代理人: 陳繼亮

1.一種晚香玉病毒的離體繁殖方法，其特征在于：該方法按以下步驟進行：

1)、培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為：

(1)基本培養基：誘導、增殖及生長培養基用MS培養基；生根培養基用1/2MS培養基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～6.0；

(2)誘導培養基：MS+6-芐基嘌呤1.0～3.0mg/L和吲哚乙酸1.0～3.0mg/L；

(3)增殖培養基：MS+6-芐基嘌呤0.5～2.0mg/L和吲哚乙酸0.5～2.0mg/L；

(4)生長培養基：MS+6-芐基嘌呤0.1～1.0mg/L和吲哚乙酸0.1～1.0mg/L；

(5)生根培養基：1/2MS+吲哚丁酸0.5～2mg/L和吲哚乙酸0.1～0.5mg/L；

2)、毒源晚香玉的組織培養：

(1)外植體的選取與滅菌：選取毒源鱗莖，剝除鱗莖外皮用自來水沖洗洗凈，經滅菌處理后，在無菌條件下，切取幼芽或將鱗莖切成0.5cm×0.5cm×0.5cm見方的切塊作為組培用外植體；

(2)誘導培養：將幼芽或鱗莖切塊接種在誘導培養基上，在培養條件下培養30～45天，從幼芽誘導成叢生芽或從鱗莖切塊誘導形成幼芽；

(3)增殖培養：將叢生芽或幼芽轉接到增殖培養基上，在培養條件下培養30～45天至增殖出叢生芽；根據對幼芽數量的需求，每隔30～45天按同樣方法進行幼芽再增殖；

(4)生長培養：將增殖的叢生芽轉接到生長培養基上，在培養條件下培養30～45天使叢生芽長高到3～5cm；

(5)生根培養：將長大的叢生芽切成單株轉接在生根培養基中，在培養條件下培養20～30天，基部長出數根根系；

(6)移栽：當生根組培苗長高至5～7cm以上、長出5根以上根時，移栽至基質中，培育1～2個月后成苗；

3)、病毒檢測：

(1)病毒提純：

取組培苗葉片或移栽成苗的葉片，低溫保存，利用差速離心結合經二輪PEG沉淀的分離法，對組培苗葉片或移栽成苗的葉片的病毒進行分離、純化，獲得病毒制劑；

(2)病毒制劑含量檢測：

利用免疫電鏡捕獲法及負染電鏡法檢測毒源晚香玉病毒含量、純度；

(3)病毒ELISA檢測：

將田間晚香玉發生的病毒，經擴增、克隆和原核表達所獲得的相關病毒外殼蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制備成病毒特異性抗血清后，對組培苗進行病毒ELISA檢測，鑒定其病毒種類；

(4)病毒的致病力測定：

利用常規摩擦法，接種晚香玉測定毒源晚香玉體內病毒的致病力；

4)、毒源晚香玉病毒的離體繁殖：

將步驟2)增殖的組培苗經病毒檢測后帶有病毒的叢生芽，根據對毒源幼芽數量的需求，每隔30～45天按將步驟2)同樣方法進行毒源幼芽再增殖。

2.根據權利要求1所述的晚香玉病毒的離體繁殖方法，其特征在于，所述的各組培階段的培養條件是，培養溫度為25±2℃，光照光強為2200～2500Lx，光照時間為16h/d。

3.根據權利要求1所述的晚香玉病毒的離體繁殖方法，其特征在于：所述的移栽基質由泥炭∶珍珠巖∶蛭石按體積比1∶3∶2配制而成。