[發(fā)明專利]含毛囊人工皮膚的制備方法及由其制備的人工皮膚

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810060267.4
• 申請日: 2008-04-03
• 公開（公告）號: CN101264344A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂中法;鄭敏;蔡綏勍;馬列;吳賢杰;高長有
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院;浙江大學(xué)
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 王鵬舉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)，涉及人工皮膚的制備方法，尤其涉及含毛囊人工皮膚的制備方法以及由該方法制備得到的人工皮膚。

背景技術(shù)

最近國內(nèi)外已成功地研制出含有真皮和表皮的人工皮膚，但這些人工皮膚尚沒有其他細(xì)胞成份，如無皮脂腺腺體細(xì)胞，皮脂腺分泌的產(chǎn)物稱皮脂，有潤滑皮膚的作用，在皮膚表面形成脂膜，形成皮膚屏障(skin?barrier)的一部分。脂膜中的游離脂肪酸對某些病原微生物的生長起抑制作用；毛囊周圍真皮組織中的成纖維細(xì)胞能產(chǎn)生天然抗生素，有抗菌防御能力。毛囊中的外毛根鞘相當(dāng)于表皮的棘層和基底層細(xì)胞，具有表皮修復(fù)能力，這些細(xì)胞還存在有多種細(xì)胞因子受體，又能分泌重要的細(xì)胞因子，成為皮膚細(xì)胞信息交換的重要場所。

因此，如果在人工皮膚中具有上述細(xì)胞成分，人工皮膚就會在功能上較為完善。由于毛囊在皮膚中的重要作用，研制出一種具有一定生理功能的含毛囊的人工皮膚對研究創(chuàng)面的正常化愈合具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。

目前臨床上適用于大面積創(chuàng)面覆蓋的人工皮膚主要是以膠原等天然材料為支架的人工皮膚，該類人工皮膚具有培養(yǎng)面積小、產(chǎn)量低、易收縮和移植成功率低等缺點；或是以合成材料為支架的，雖易生產(chǎn)，但易于感染，移植成功率低，沒有表皮層，不利于細(xì)胞生長；人工皮膚的研究重點集中在基質(zhì)的改善和抗感染能力方面，對人工皮膚中的細(xì)胞成份研究較少，雖然近年來國內(nèi)外已成功地研制出含真皮和表皮的人工皮膚，并具有一定的抗感染能力。

毛囊是細(xì)胞生物學(xué)和皮膚病學(xué)等學(xué)科的研究熱點，它涉及毛囊真表皮間相互作用、信號傳導(dǎo)、生長因子和細(xì)胞因子的作用、毛囊生長周期的調(diào)控、毛發(fā)的色素、毛發(fā)的定型、毛囊干細(xì)胞的定位及其生物學(xué)功能等多個方面，現(xiàn)在已初步闡明毛囊干細(xì)胞定位于毛囊外根鞘的立毛肌附著處。如何利用皮膚毛囊干細(xì)胞在人工皮膚中發(fā)揮重要的生理功能已成為發(fā)展趨勢。

毛囊的功能：毛囊是皮膚的主要輔助器官，它具有重要的生理功能：如皮膚的屏障作用，抗菌作用，抑制疤痕形成作用；同時毛囊是表皮-毛囊-皮脂腺單位干細(xì)胞的所在部位，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境因素刺激下毛囊干細(xì)胞可定向分化為表皮、毛囊和皮脂腺組織，這些組織細(xì)胞及其細(xì)胞因子對創(chuàng)面的正常化愈合具有不可替代的作用。

我們的前期研究應(yīng)用鼠觸須毛囊細(xì)胞在膠原/殼聚糖多孔支架上成功地研制出含毛囊的人工皮膚(專利申請?zhí)枮椋?00510050538.4)，其公開了一種含毛囊人工皮膚的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)：分離鼠觸須毛囊，加入分離酶消化，離心，得毛囊上皮細(xì)胞；取去除毛干的鼠觸須毛囊用膠原酶D消化，離心，用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行真皮鞘細(xì)胞培養(yǎng)和進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)；將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞分別與毛囊上皮細(xì)胞按5-1∶1-5比例進(jìn)行混合，移植到膠原/殼聚糖多孔支架上，加入DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)即得。該發(fā)明方法解決了大面積燒創(chuàng)傷中皮膚來源困難的難題。但由于所用細(xì)胞來源于動物，因其抗原性使其臨床應(yīng)用受限，如果能用人的毛囊細(xì)胞研制出含毛囊的人工皮膚，將會大大縮短臨床應(yīng)用研究時間。對研究創(chuàng)面的正常化愈合和大面積燒傷的創(chuàng)面覆蓋具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述的人工皮膚所用細(xì)胞來源于動物，因其抗原性使其臨床應(yīng)用受限的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的一個目的是提供一種含人毛囊人工皮膚的制備方法，其使人工皮膚得抗原性大大減弱，解決了大面積燒創(chuàng)傷中皮膚來源困難的難題。

本發(fā)明的另外一個目的是提供由上述的制備方法得到的含毛囊人工皮膚。

為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

含毛囊人工皮膚的制備方法，其包括以下步驟：

(1)毛囊上皮細(xì)胞制備：分離人頭皮毛囊，加入分離酶，消化，再將毛囊移入緩沖鹽溶液中，飄洗去除分離酶，從毛囊中擠出毛干，用0.125-0.25％胰蛋白酶加EDTA消化成單個毛囊上皮細(xì)胞，離心去除胰蛋白酶，用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)備用；

(2)毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)：將去除毛干的人毛囊用0.1-0.5％的膠原酶VI消化，待包繞毛囊的真皮鞘消化成單細(xì)胞而其內(nèi)的毛乳頭尚未開始消化時，中止消化，液洗，低速離心去除膠原酶VI，吸沉淀過200-400目的篩網(wǎng)，倒沖篩網(wǎng)，用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)備用；