[發明專利]一種制備T載體的方法

無效

• 申請號: 200810059986.4
• 申請日: 2008-03-07
• 公開（公告）號: CN101240286A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 周耐明;李果
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/64;C12N15/66
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種制備T載體的方法。

背景技術

PCR(Polymerase?chain?reaction)是分子生物學和基因工程研究中的常規實驗技術，也是基因克隆中最強有用的工具之一，是目前研究基因或DNA片段的必經之路。在絕大多數情況下，需要將PCR擴增產物克隆到質粒載體上，以便對PCR產物進行測序、體外轉錄、體外翻譯等操作。

克隆PCR產物的方法有很多種，但最直接最方便的方法就是T/A克隆法。T/A克隆法是伴隨著PCR技術而發展起來的一種克隆方法。所謂TA克隆就是將3’端具有單個A尾巴的PCR產物克隆到3’具有單個T尾巴的T載體上。在PCR擴增過程中，由于許多耐熱性DNA聚合酶如Taq酶等具有不依賴于模板的末端轉移酶活性而在PCR產物的3’末端添加單個脫氧核苷酸，并且偏好添加四種脫氧核苷酸中的腺嘌呤脫氧核苷酸(A)，從而使得50％以上的PCR產物的3’末端具有單個腺嘌呤脫氧核苷酸，即3’端A尾巴。

介于此，人們開發出一種3’末端帶一突出“T”的特殊載體-T載體，以用于克隆Taq酶擴增的PCR產物或其它以Taq酶做A-Tailing操作的線性DNA片段。這項技術有效地克服了傳統克隆技術很多固有的缺點，如載體容易自連，克隆效率低，篩選陽性克隆難度大，實驗費用高等。目前用到的T載體大多為商品化的載體，根據其構建策略不同主要分三類：

1.利用產生平末端的內切酶將環狀質粒酶切成線性質粒，然后利用末端轉移酶將單個雙脫氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到線狀載體的3’末端。

2.在高濃度ddTTP的存在下，被產生平端的內切酶消化后的載體與Taq酶溫育，由于Taq酶在不存在dATP的情況下有相對良好的3’末端加”T”能力，因此可以在線性化載體的平滑末端的3’端添加一個“T”，制成T載體。

3.在質粒載體的多克隆位點中引入特定的限制性內切酶酶切位點，用相應的內切酶酶切產生3’末端具有單個T突出的線性T載體。

前兩種方法制備的T載體由于有生產廠商的嚴格質量控制，其效率可達70％或更高，基本可以滿足常規的克隆操作。但由于其操作步驟較多，質量不宜控制，且在制備過程中存在加尾效率低以及線性化質粒在加尾過程中其兩端的序列有時會被部分刪除等問題，導致這種T載體只能由專業的公司來生產。

與前兩種方法相比，第三種方法更快捷、更高效、更穩定而且更容易制備?？捎脕碇苽銽載體的限制性內切酶包括：XcmI、AhdI及其同裂酶Eam1105I/EcIHKI/NruGI/AspEI、HphI、MboII及BfuI等。其中XcmI及其同裂酶在制備T載體種應用的最為廣泛。其它內切酶要么因為太昂貴，要么在普通的克隆載體上有太多的識別位點，因而在制備T載體種的應用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆載體中，如pBlueScript?II?KS或pUC18或pUC19載體等，因而在這些載體的多克隆位點引入XcmI位點更為方便些，這就是為什么更多人采用XcmI制備T載體。

然而，無論是XcmI還是上述其它限制性內切酶構建T載體時均存在兩個潛在的問題：酶切不完全和酶切后連接效率低。

所謂酶切不完全即部分酶切的前T載體混雜在T載體中會導致非重組轉化子的本底過高(Harrison，J.，Molly，P.L.，and?Clark，S.J.(1994).Directcloning?of?polymerase?chain?reaction?products?in?an?XcmI?T-vector.Anal.Biochem，216，235-236；Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.，and?Smith，L?M.(1991).A?universal?method?for?the?direct?cloning?of?PCRamplified?nucleic?acid.Bio?Technology，9，657-663.Borovkov，A.Y.，Rivkin，M.I.，1997.XcmI-containing?vector?for?direct?cloning?of?PCR?products.BioTechniques，22，812-814)。