[發(fā)明專利]一種快速提取真菌DNA的SLS裂解液及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810059177.3
• 申請(qǐng)日: 2008-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN101230344A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳廣進(jìn);李紅葉;張志芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速提取真菌DNA的SLS裂解液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

常用的真菌DNA提取方法有CTAB提取法(Saghai，M.A.K.M.Soliman，R.A.Jorgensen&R.W?Allard，1984，Ribosomal?DNA?spacer-lengthpolymorphism?in?barley：Mendelian?inheritance，chromosomal?location?andpopulation?dynamics.Prov.Natl.Acad.Sci.USA，81(24)：8014-8018.)、尿素提取法(Sun，Y，W.Zhang，F(xiàn).Li，Y.Guo，T.Liu?&H.Huang，2000，Identification?and?genetic?mapping?of?four?novel?genes?that?regulate?leafdevelopment?in?Arabidopsis.Cell?Research，10(4)；325-335.)、SDS提取法(He，Y.Q.2000，An?improved?protocol?for?fungal?DNA?preparation.Mycosystema，19(3)：434.)等。這些方法的主要技術(shù)路線是：利用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌，收集菌絲，用液氮研磨破碎細(xì)胞壁，再用各提取液提取DNA，經(jīng)過純化獲得DNA沉淀。通過這些方法一次可提取大量DNA，但這類方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)：

(1)不包括菌絲培養(yǎng)，僅平均提取時(shí)間就需要3h～12h；

(2)加液氮后，需要強(qiáng)力研磨，實(shí)際操作難度較大；

(3)一次提取的樣品數(shù)量受研缽數(shù)量的限制，且容易產(chǎn)生交叉污染。

在一些利用已知序列開展真菌的分子鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化研究、抗藥性分子檢測(cè)和轉(zhuǎn)化子鑒定等工作當(dāng)中，往往一次需要提取很多種樣品的DNA，而對(duì)每種樣品的DNA的需求量不大。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便的真菌DNA提取方法十分必要。

N-月桂酰肌氨酸鈉(SLS)是一種陰離子型氨基酸類表面活性劑，具有低毒、低刺激性和良好的生物降解性等特點(diǎn)(李紅、黎四芳、蔡蘭珍，2004，N-月桂酰肌氨酸鈉的合成與應(yīng)用。精細(xì)石油化工進(jìn)展，5(3)：35-38)。

中國專利申請(qǐng)01142507.5公開了一種DNA提取方法，包括以下步驟：(1)用裂解液處理樣品并離心得到含有DNA的上清；(2)過濾步驟(1)中的上清得到濾液；(3)向上述(2)的濾液中加入萃取劑處理并離心得到上清液；(4)向上述(3)中的上清中加入樹脂用于吸附DNA；(5)洗脫吸附于樹脂上的DNA并離心得到含有DNA的濾液；(6)沉淀濾液中的DNA。

該專利提取DNA的方法操作復(fù)雜，步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種快速提取真菌DNA的SLS裂解液，該裂解液應(yīng)用于真菌DNA的提取，可簡(jiǎn)化操作步驟，提高DNA的提取效率，降低成本。

一種快速提取真菌DNA的SLS裂解液，由以下組分組成(以溶液總體積計(jì))：

N-月桂酰肌氨酸鈉????1～3g/100ml

Tris-HCl????????????150～300mmol/L

NaCl????????????????150～300mmol/L

EDTA????????????????50～100mmol/L

水??????????????????余量

PH值為7.5～8.5。

保持裂解液的弱堿性，有利于提高對(duì)真菌細(xì)胞的裂解作用。

上述SLS裂解液應(yīng)用于提取真菌DNA的方法，包括以下步驟：

(1)將真菌菌絲加入SLS裂解液中，在50～80℃下水浴加熱10～15min后離心。

離心轉(zhuǎn)速為13000r/min～15000r/min。

(2)將萃取劑加入步驟(1)離心所得的上清液中抽提DNA，再次離心。

萃取劑為氯仿和異戊醇的混合溶劑，體積比為24∶1，也可選用苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶劑，其體積比為25∶24∶1。萃取劑與步驟(1)制得的上清液體積比為1∶1～2∶1。

離心轉(zhuǎn)速為13000r/min～15000r/min。

(3)將DNA沉淀劑加入步驟(2)離心所得的上清液中混合均勻，靜置后離心沉淀DNA。

所述的DNA沉淀劑為無水乙醇或異丙醇。