[發明專利]含太子參環肽B組培苗的培養方法

無效

• 申請號: 200810058900.6
• 申請日: 2008-09-11
• 公開（公告）號: CN101352147A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 朱宏濤;許文彥;張穎君;譚寧華;唐軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;G01N33/48;G01N30/02
• 代理公司: 云南協立專利事務所
• 代理人: 馬曉青

1、含太子參環肽B組培苗的培養方法，包括以下步驟：

(1)太子參叢生芽的誘導、培養：取太子參幼枝，經洗滌消毒后，無菌顯微條件下剝離莖尖的葉片，取帶有生長點的莖尖置于叢生芽培養基中培養；

(2)太子參組培苗培養系的建立及太子參環肽B含量測定：將步驟(1)所得叢生芽近頂端部分切成0.8-1.0cm帶節間的外植體置于生根培養基內，20-25℃條件下光照培養誘導生根，生根后繼續培養，并對太子參環肽B的含量進行測定。

2、根據權利要求1所述的含太子參環肽B組培苗的方法，其特征是經過步驟(1)和(2)之后，可進一步進行下述第(3)步驟：

(3)太子參不定根的液體培養與太子參環肽B含量測定：將步驟(1)和(2)太子參組培苗中誘導出的不定根用解剖刀切下，用無菌蒸餾水洗去不定根表面的培養基，在無菌條件下稱取0.5g置于液體培養基中，在100-130r/min的旋轉震蕩器中懸浮培養；同時進行太子參環肽B的含量測定。

3、根據權利要求1所述的含太子參環肽B組培苗的培養方法，其特征是步驟(1)中所采用的消毒方法為：太子參幼枝用自來水清洗3-5遍，置于肥皂液中浸泡1小時后再用流水沖洗1-2小時，取出用無菌濾紙吸干表面水分，用75％的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用無菌水沖洗3次，吸干表面水分后置于10％的過氧化氫溶液中浸泡13分鐘，取出后用無菌蒸餾水沖洗6次，吸干表面水分并在無菌顯微條件下進行莖尖剝離后置于叢生芽誘導培養基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L中培養。

4、根據權利要求1所述的含太子參環肽B組培苗的培養方法，其特征是步驟(2)是將步驟(1)中所得的叢生芽置于MS固體培養基中分別加入奈乙酸(NAA)0.1-2.0mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1-3.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1-4.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤(KT)0.1-2.0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0.1-1.0mg/L、脫落酸(ABA)0.1-1.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L中的一種或幾種植物激素所配制的培養基中進行不定根的誘導；滅菌前培養基PH值精密調至6.5；太子參組培苗中太子參環肽B的含量用高效液相色譜(HPLC)測定，條件如下：安捷倫生產的Agilent?1100?series；色譜柱為Agilent?ZORBAX?SB-C18，5μm，4.6×150mm；柱溫：30℃；流動相為水∶乙腈＝73∶27；流動相流速：1ml/min；檢測波長：192nm；HB的保留時間(RT)為14.003min；總環肽溶液進樣后收取14min的吸收峰進行FAB-質譜分析，得到分子量為777的[M-1]^-峰，證明為太子參環肽B[M＝778]。

5、根據權利要求1或4所述的含太子參環肽B組培苗的培養方法，其特征是將步驟(1)中所得的叢生芽置于MS固體培養基中分別加入奈乙酸(NAA)0.1-2.0mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1-3.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1-4.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤(KT)0.1-2.0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0.1-1.0mg/L、脫落酸(ABA)0.1-1.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L中的一種和幾種植物激素所配制的培養基NAA或NAA+IBA或NAA+IBA+2.4D或NAA+IBA+ABA或NAA+IBA+6-BA或NAA+IAA+6-BA或NAA+IBA+IAA+KT或NAA+IBA+IAA+KT+6-BA中進行不定根的誘導。

6、根據權利要求2所述的含太子參環肽B組培苗的培養方法，其特征是步驟(3)是將步驟(2)中叢生芽直接誘導出的太子參環肽B含量較高即不低于850.31μg/g組培苗干重的不定根從組培苗中切下，洗去培養基后精密稱量0.5g接種到含有奈乙酸0.1-2.0mg/L、吲哚丁酸0.1-4.0mg/L、卞基氨基嘌呤0.1-1.0mg/L的1/2MS液體培養基中，懸浮擴大培養，其含量測定方法同權利要求4的步驟(2)。

7、根據權利要求1所述的含太子參環肽B組培苗的培養方法，其特征是太子參環肽B含量分析采用Exel軟件進行分析評價。