[發明專利]利用基因工程生產限制性內切酶的方法

有效

• 申請號: 200810057659.5
• 申請日: 2008-02-04
• 公開（公告）號: CN101225396A
• 公開（公告）日: 2008-07-23
• 發明（設計）人: 安海謙;魯剛偉;冉波;梅小偉;柳輝
• 申請（專利權）人: 金普諾安蛋白質工程技術（北京）有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N15/74;C12N9/16
• 代理公司: 北京銘碩知識產權代理有限公司
• 代理人: 郭鴻禧;李云霞

????????????????????????技術領域

本發明涉及一種利用基因工程生產限制性內切酶的方法。

????????????????????????背景技術

限制性內切酶是特異性識別DNA序列并在特定點將其切斷的工具酶，它們來源于不同的微生物，是細菌防御外來病毒入侵的武器。在20世紀60年代中期，科學家推測細菌中有限制-修飾系統(restriction-modificationsystem，R-M?system)。該系統中有作用于同一DNA序列的兩種酶，即，消化DNA的限制酶和改變DNA堿基結構使其免遭限制酶分解的修飾酶，并且這兩種酶作用于同一DNA的相同部位。一般說來，不同的細菌或不同的細菌菌株具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制-修飾系統。

這些酶自七十年代后期在基因工程、分子生物學上被廣泛應用，已有30年歷史。目前商品化的酶有230多種，常用酶有50多種。隨著基因克隆技術的應用，大大簡化了限制性內切酶的生產過程，酶的純度也更好。與一般基因工程工具酶不同，限制性內切酶可將自身DNA切斷而導致菌體不能存活。所以要在大腸桿菌內工程化生產這種酶，必須先將這種酶的修飾酶基因導入菌體并預先表達，或通過這種酶的限制-修飾調控序列來精確調控兩種酶的表達順序?，F有的克隆技術以及限制-修飾系統理論研究的限制使得工程菌株很難實現基因可誘導性表達?，F有技術中生產限制性內切酶的方法主要是將限制-修飾及調控基因以鳥槍法克隆入質粒，靠質粒的高拷貝數實現目的蛋白高表達。這種生產方法的產量低、純度差并且生產成本高，所以需要開發一種產量高、純度好并且生產成本低的生產限制性內切酶的方法。

?????????????????????發明內容

本發明提供了一種生產限制性內切酶的方法，利用該方法生產酶的產量高、酶的純度好并且成本低。

根據本發明的生產限制性內切酶的方法包括以下步驟：將與所述限制性內切酶相對的修飾酶基因克隆到載體的上游；在修飾酶的保護下，將限制性內切酶基因克隆至同一載體強啟動子下游的多克隆位點中；轉化表達宿主菌；篩選穩定、可誘導、高表達的限制性內切酶的菌株。

本發明上述方法中的修飾酶基因可選自甲基化酶基因，例如BHIM甲基化酶基因。

本發明方法中采用的載體可以是適合原核宿主的任何載體，優選地為pEEB載體。

本發明方法中采用的宿主菌可以是任何原核宿主細胞。優選地為大腸桿菌。