[發明專利]一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法

無效

• 申請號: 200810056007.X
• 申請日: 2008-01-11
• 公開（公告）號: CN101481714A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 袁其朋;程艷;張倩
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司
• 代理人: 霍京華

技術領域：

本發明涉及一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法。屬食品、醫藥、化工領域。

背景技術：

鞣花酸(2，3，7，82tet?rahydroxybenzopyrano[5，4，3cde]benzopyran—5，10—dione)，是廣泛存在于各種軟果、堅果等植物組織中的一種天然多酚組分，它是沒食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內酯。它不僅能以游離的形式存在，而且更多的是以縮合形式(如鞣花單寧、苷等)存在于自然界。純鞣花酸是一種黃色針狀晶體，熔點(吡啶)大于360℃，微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚。鞣花酸分子式C₁₄H₆O₈，分子量為302，其結構如下：

近十年來，由于發現了鞣花酸的抗突變、抗癌變效應，以及對化學致癌物質的抑制作用，引起了人們廣泛的關注。

鞣花酸的制備方法主要有以下幾種方法：

一種是從植物中提取鞣花酸。自然界中，紅木莓、草莓、石榴以及蕨類等植物中含有少量鞣花酸(1％)。目前，國際上約有四五家工廠在以草莓、石榴為原料，可生產出含量為5％左右的天然鞣花酸提取物，用于食品添加劑；用此工藝可生產高純度的鞭花酸，但由于原料成本較高、且原料中鞣花酸含量的限制而實際意義不大。

一種是通過倍酸(或其酯)的氧化聚合。沒食子酸在過氧化物酶的氧化作用下，(見Nrusingha?C.Mishra?and?Barry?Gold.Synthesis?of?13c-and?14c-labrleddllagic?acid[J].Journal?of?Labelled?Compounds?and?Radiopharmaceuticals，1990，8：927-94)其主要產物是鞣花酸。此工藝過程中，鞣花酸的產率為20％～30％。但沒食子酸(酯)的制備過程繁瑣復雜，酶也需要精制純化，而且產物中還有一種未知的醌類物質，其與鞣花酸的比例為1∶2.4，給產品的分離純化帶來了一定的困難，目前較少用此法進行鞣花酸的生產。

微生物法生產鞣花酸是利用橡碗單寧為原料，在發酵過程中產生鞣花酸，由于鞣花酸不溶于水，發酵過程中有大量的菌絲體產生，并且這種方法反應時間長，為后續的分離純化帶來了很大的困難。也不易于得到高純度的鞣花酸。

發明內容：

本發明的目的是提供一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法。通過發酵獲得含降解鞣花單寧的酶的菌體，經過超聲破碎，得到粗的單寧酶，與石榴皮中提取的鞣花單寧發生酶促反應，分離純化獲得純度較高的鞣花酸。實現降低成本，廢物利用，提高鞣花酸產量和純度的目的。

本發明的以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法，通過可降解鞣花單寧的單寧酶與鞣花單寧進行酶促反應，得到鞣花酸粗產品，經溶劑結晶純化獲得純鞣花酸，具體步驟和條件為：

A鞣花單寧的提取

將烘干的石榴皮粉碎后，加入到體積濃度為20～60％的乙醇水溶液中，置于功率為80-100W的超聲波作用下超聲處理2-3次，每次25-40分鐘，得到鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮回收乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液；

B單寧酶的發酵培養

將黑曲霉Aspergillus?niger3.316接種于發酵種子培養基中，25-30℃下培養20-24小時，移至產酶培養基中，25-30℃下培養4-6天，離心并用去離子水洗滌，獲得含單寧酶的菌體，加入pH＝5.0的檸檬酸緩沖液后得到菌懸液，菌懸液于冰浴中在功率400-600W的超聲波作用下進行20-30分鐘超聲破碎，得到粗的單寧酶；

C酶促轉化反應

將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至原來體積的1-2倍，用NaOH水溶液調節pH至5.0-5.5，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧溶液的體積比為1：2-3，25-30℃下酶促轉化反應40-48小時，反應液經過濾，得到粗鞣花酸產品；

D溶劑結晶純化

將步驟C得到的鞣花酸粗產品加入甲醇，在70～80℃溫度下萃取3～9小時后，將萃取液濃縮至飽和，降至室溫結晶，反應液過濾后，濾餅經水洗、干燥，得到淡黃色鞣花酸產品，純度為95％以上。