[發(fā)明專利]一種地衣芽孢桿菌菌株及用途和用其生產(chǎn)聚γ-谷氨酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810055068.4
• 申請日: 2008-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN101603015A
• 公開（公告）日: 2009-12-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳守文;謝萍;魏雪團(tuán);劉曉雷;冀志霞;郭威;張紅艷;孫君偉;李海濤;李建波;米造吉;黃品奇;王正品
• 申請（專利權(quán)）人: 河北維爾康制藥有限公司;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P13/00;C12R1/10
• 代理公司: 石家莊國域?qū)＠虡?biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 白海靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及芽孢桿菌及其用途，具體地說是地衣芽孢桿菌菌株及用途和用其生產(chǎn)聚γ-谷氨酸的方法。

背景技術(shù)

地衣芽孢桿菌(Bacillus?Licheniformis)是一類自然界廣泛存在的兼性厭氧腐生菌。在工業(yè)上常常作為蛋白水解酶、淀粉酶、生物活性劑、抗生素等的生產(chǎn)菌。目前已有研究者采用特定的地衣芽孢桿菌生產(chǎn)聚γ-谷氨酸，如有人采用地衣芽孢桿菌A35生產(chǎn)聚γ-谷氨酸(詳見參考文獻(xiàn)1：Cheng?C，Asada?Y，AaidaT.Production?of?γ-polyglutamic?acid?by?Bacillus?licheniformi?A35?underdenitrifying?conditions.Agric?Biol?Chem，1989，53：2369-2375；)。但采用該菌株生產(chǎn)聚γ-谷氨酸存在發(fā)酵周期長，發(fā)酵產(chǎn)率低的缺陷。為了解決這一問題，有研究者公開了一種采用地衣芽孢桿菌(B.licheniformis?ATCC9945A)生產(chǎn)聚γ-谷氨酸的方法(詳見參考文獻(xiàn)：US?Patent?5378807，1995；Yoon?SH，DO?JH，Lee?SY.Production?of?poly-γ-glutamic?acid?by?fed-batch?culture?of?Bacilluslicheniformis.Biotechnology?Letters，2000，22：585-588)。上述方法雖然對聚γ-谷氨酸的產(chǎn)量有所提高，但其在發(fā)酵過程中需添加高濃度的甘油，故其生產(chǎn)成本高。由于聚γ-谷氨酸[Poly(γ-glutamic?acid)，γ-PGA](以下簡稱γ-PGA))在醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，因此，發(fā)明一株具有良好生產(chǎn)γ-PGA特性的地衣芽孢桿菌就具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的就是要提供一種可克服現(xiàn)有地衣芽孢桿菌菌株缺陷的新地衣芽孢桿菌菌株，同時(shí)提供一種該菌株的用途以及用該菌株生產(chǎn)聚γ-谷氨酸的方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明所提供的新的地衣芽孢桿菌菌株，其保藏名稱為一株地衣芽孢桿菌WX-02，保藏單位在CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M208065。保藏日期2008年4月28日。

本發(fā)明的菌種的分離與篩選方法是：

稱取湖北應(yīng)城鹽礦高鹽環(huán)境土樣1g于滅菌試管中，加無菌水9mL，用棉塞封口，振蕩2min，然后放水浴鍋中，80℃加熱10分鐘，再靜置30min。冷卻后，吸取上清液0.1mL，稀釋10^-2，10^-3，分別取0.2mL，涂布LB平板，37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，挑選在LB培養(yǎng)基上呈乳液狀能拉絲的單菌落，接入新鮮液體種子培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h后，按2％的接種量分別接種到裝有50mL滅菌基本發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃，190r/min，振蕩培養(yǎng)36h結(jié)束發(fā)酵。對發(fā)酵產(chǎn)物分別取樣離心除去菌體，用3倍乙醇沉淀上清液，輕輕振蕩后12000r/min離心15min，收集沉淀物，冷凍干燥，再加入蒸餾水溶解沉淀物，透析去除離子，利用HPLC檢測產(chǎn)物。將篩選到的菌株按照規(guī)定方法進(jìn)行菌種鑒定。

本發(fā)明所提供的新地衣芽孢桿菌菌株菌體直桿狀，革蘭氏染色陽性，芽孢近似圓形，偏端生。在LB固體培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣不齊，毛發(fā)狀，菌苔干燥，不透明，蔓延，灰白色。最適生長溫度30-37℃，適宜pH6.8-7.2。接觸酶實(shí)驗(yàn)陽性，硝酸鹽利用陽性，檸檬酸鹽利用陽性，明膠液化實(shí)驗(yàn)陽性。

本發(fā)明所提供的新地衣芽孢桿菌菌株16S?rRNA基因序列有1263個(gè)堿基，經(jīng)采用Genebank登記號(hào)：EU564336對比16S?rRNA分子鑒定與前面的生理生化鑒定結(jié)果結(jié)合分析，鑒定為芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種該地衣芽孢桿菌菌株的用途，即該菌株用于生產(chǎn)聚γ-谷氨酸。

本發(fā)明同時(shí)提供了一種用該菌株生產(chǎn)聚γ-谷氨酸的方法。該方法包括以下步驟：

a、采用地衣芽孢桿菌WX-02、保藏單位CCTCC、保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M208065、保藏日期2008年4月24日的菌株作為生產(chǎn)菌株；

b、將上述WX-02菌株接在LB培養(yǎng)基固體斜面上30℃-37℃培養(yǎng)；刮取菌苔至無菌的20％甘油保藏管中；-60～-70℃冷凍保藏；

c、制備種子液：

(1)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，30℃-37℃培養(yǎng)24-36小時(shí)，使其活化；