[發明專利]消減免疫法制備大腸桿菌0157︰H7抗原單克隆抗體的方法

無效

• 申請號: 200810053955.8
• 申請日: 2008-07-25
• 公開（公告）號: CN101323642A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 李君文;郎婧;金敏;諶志強;王新為;陳照立;邱志剛;王景峰
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及一種制備單克隆抗體的免疫方法，特別是涉及一種消減免疫法制備大腸桿O157:H7抗原單克隆抗體的方法。

背景技術

1975年Kohler和Milstein發表了“分泌預定特異性抗體融合細胞的持續培養”的論文，單克隆抗體技術從此問世。單克隆抗體技術已是現代生命科學研究的重要工具。常規的雜交瘤技術通常并不能獲得特定目的抗原的單克隆抗體。常規技術制備細菌抗原單克隆抗體，通常采用生物化學方法分離純化天然蛋白質作為免疫原，然后將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，用免疫原篩選出分泌抗目的蛋白抗體的細胞株。由于絕大部分的天然蛋白表達量很低，用生物化學方法分離純化難度大，成本高，現已很少使用。利用基因工程技術可表達目的蛋白質，但此方法存在制備周期長和抗體親合力相對較弱等不足之處，主要原因是因為大多數蛋白質都采用大腸桿菌表達系統，表達蛋白后無修飾，不具備天然蛋白的構象，尤其對那些需要糖基化、磷酸化等修飾作用的蛋白。實驗證明用某些原核表達蛋白免疫動物制備的抗血清只能與變性蛋白反應，而很難結合天然抗原，這種現象在用桿狀病毒表達的蛋白中也存在。盡管這類抗體能用于Western?Blot實驗，但研究天然蛋白的結構與功能及對病原微生物的檢測則受到很大的限制。而用真核表達系統如酵母、昆蟲和哺乳類動物細胞表達蛋白質，存在著實驗周期更長、表達產量更低、技術難度更大等問題。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種使免疫系統直接靶向目的抗原決定簇，來大幅增加目的抗原單抗的產生數目，并減少單抗篩選的工作量的消減免疫法制備大腸桿菌O157:H7抗原單克隆抗體的方法。

本發明的技術方案概述如下：

消減免疫法制備大腸桿菌O157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟：

(1)選取4-8周齡雌性BALB/c小鼠；

(2)用除大腸桿菌O157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的6-16min、18-30h和40-60h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺50-150mg，用間接ELISA檢測小鼠耐受情況；

(3)每隔兩周重復步驟(2)，直至BALB/c小鼠對所述耐受原耐受；

(4)在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的7-14d、14-21d、28-35d，以大腸桿菌O157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌O157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而與大腸桿菌O157:H7反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體。

所述步驟(1)優選的是：選取5-6周齡雌性BALB/c小鼠。

所述步驟(2)為：用除大腸桿菌O157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的8-12min、22-26h和46-50h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺50-150mg，用間接ELISA檢測小鼠耐受情況。

所述除大腸桿菌O157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為大腸桿菌44752、大腸桿菌44186、大腸桿菌44824、大腸桿菌44336或大腸桿菌44102，還可以選用其它的大腸桿菌。

所述步驟(4)為：在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的9-11d、16-18d、30-32d，以大腸桿菌O157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌O157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而與大腸桿菌O157:H7反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體。

本發明的方法可在不純化抗原的基礎上，較容易的獲得細菌抗原的單克隆抗體；本發明的方法能提高免疫效果，減少單抗篩選的工作量獲得預期的單克隆抗體。

附圖說明

圖1為常規免疫法雜交瘤技術示意圖；

圖2為消減免疫法雜交瘤技術示意圖；

圖3為BALB/c獲得了對大腸桿菌44752的耐受情況；

圖4為消減免疫效果。

具體實施方式