[發明專利]一種抗雞新城疫病毒轉移因子的制備方法

無效

• 申請號: 200810053541.5
• 申請日: 2008-06-17
• 公開（公告）號: CN101298467A
• 公開（公告）日: 2008-11-05
• 發明（設計）人: 田杏芳;王連民
• 申請（專利權）人: 天津生機集團股份有限公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K1/34;A61P31/14
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司
• 代理人: 閆俊芬

技術領域

本發明涉及藥物及其制劑領域，更具體地說，是涉及一種抗雞新城疫病毒轉移因子的制備方法。

背景技術

雞新城疫是由雞新城疫病毒引起的急性呼吸道傳染病。雞新城疫病毒的最大特點就是容易發生變異，導致雞體內已經出現的抗雞新城疫病毒特異性抗體失去中和病毒的作用，因而使雞容易感染，甚至造成大規模流行。病雞受雞新城疫病毒感染后發生腹瀉、呼吸困難等癥狀，重者可導致死亡。

盡管目前已經有一些抗雞新城疫病毒的藥品或制劑：但是由于現有藥品制劑的針對性不強，療效有限，而且，治療性制劑多是在發病后才應用的，不能起預防作用。對于新城疫的易感雞群，每年定期對雞接種新城疫疫苗是預防新城疫的有效方法。其次應增強營養或藥物干預，提高自身免疲力。通過藥物提高機體抵杭力或調節免疫力也是一種預防新城疫的有效方法，轉移因子可起到此作用。

轉移因子(TF，Transfer?Factor)是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復合物，它能將供體的某種特定的細胞免疫功能特異地轉移給受體正常的淋巴細胞，參與機體的免疫反應，提高受體機體的細胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等非細菌性感染；同時促進B淋巴細胞的抗體分泌作用，能夠誘導細胞釋放干擾素和白介素，從而增強受體的免疫功能。

目前已報道的轉移因子的提取方法都是關于非特異性轉移因子的制備方法。例如，中國發明專利申請“制備轉移因子的工藝方法——全濾法”(專利申請號：200310118439.6)則公開了采用壓濾、超濾、納濾幾種方法連續過濾的制備工藝。另一份中國發明專利申請“制備轉移因子的工藝方法——加熱法”(專利申請號：200410039444.2)是由同一申請人在前一份申請的基礎上加上加熱處理的步驟，仍然是連續采用多種過濾法的制備工藝。上述專利申請的內容是對破碎后的組織經冷凍離心后直接進行過濾提取，同樣存在細胞破碎不完全的缺陷，而且其工藝煩瑣，時間較長，對產物的活性損失也較大，因此得率很難提高。

豬脾臟和胸腺是免疫活性細胞聚集的場所，而且材料來源非常廣泛，因此從這類細胞中提取特異性轉移因子，有重要的理論意義和現實意義，但目前尚未見報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術中存在的不足，提供一種天然高效純生物活性物質抗雞新城疫病毒轉移因子的制備方法。

本發明抗雞新城疫病毒轉移因子的制備方法，按照以下步驟進行：

(1)制備病毒抗原：將雞新城疫病毒接種于10天齡雞胚尿囊液，33℃下48-72小時，取雞胚尿囊液，裝厚壁小瓶子內，超聲打碎，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣留上清；

(2)提取病毒抗原：取離心上清，然后不連續梯度密度離心純化提取病毒抗原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制備的不連續梯度密度離心管，超速離心，110,000-165,000轉/分3小時，根據雞新城疫病毒所在離心管位置，吸出雞新城疫病毒備用；

(3)用上述提取的病毒抗原免疫豬：挑選健康的豬，取制備的病毒抗原，用上述提取病毒抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內或皮下多點注射免疫，第3次和第4次后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-10天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾臟和胸腺于冰上，轉移至-20℃保存，備用；

(4)從免疫豬中提取抗雞新城疫病毒轉移因子：

①原材料的制備及預處理：將病毒免疫接種豬的脾及淋巴結組織，用冷三蒸水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復沖洗；

②破碎：將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；

③凍融：將勻漿液置于-80℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融4-6次，每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎；

④提取：加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機于5℃以4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；

⑤超濾：將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子；

⑥除菌：將超濾得到的濾液用孔徑為0.22um的濾膜加壓過濾除菌；