[發明專利]利用分子生物學技術定量檢測納米材料生物安全性的方法

無效

• 申請號: 200810053171.5
• 申請日: 2008-05-21
• 公開（公告）號: CN101280341A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 張治洲;沈汵超;劉清岱;楊文娟;賀林
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明涉及生物技術領域和納米技術領域，涉及一種利用分子生物學技術定量檢測納米材料生物安全性的方法。

背景技術

納米技術作為本世紀的前沿技術已受到許多國家的極大重視，但是伴隨納米科學技術的高速發展，不僅使人們已經認識到納米材料的優點和巨大的潛力，同時納米材料也會對人類產生許多負面效應。納米材料由于尺寸小，具有特殊的理化性質，與常規物質相比更容易進入細胞并影響細胞的功能。已有報道顯示具有納米尺度的顆粒會引發生物體免疫系統的炎癥反應，造成哮喘甚至心血管疾病。隨著納米材料越來越多的出現在人類的生產和生活中，納米材料生物效應(安全性)的研究迫在眉睫，這將關系到納米技術的廣泛應用及長遠發展。

生命的遺傳是基因組DNA準確地復制的過程，復制過程中突變率的改變必將引起基因突變，從而誘發癌變，因此分析不同種類的納米材料對基因擴增準確度所帶來的影響可以從分子水平探索納米材料的生物安全性問題。基因不僅可以在細胞中進行復制，在體外也可以通過聚合酶實現基因擴增。其中聚合酶鏈式反應(PCR)是一種在體外模擬DNA體內復制的基因擴增技術，能在耐熱DNA聚合酶的作用及特異性引物的引導下，在很短的時間內就能在一個試管內實現只有在生物體細胞分裂增殖時才出現的基因的大量復制，一般來說，在數小時內就可以將目的基因擴增至百萬倍。此外，滾環擴增技術(RCA)、鏈置換擴增技術(SDA)等技術也可以實現體外基因擴增。因此將納米材料添加到基因擴增體系，對產物突變率的檢測可以研究納米材料對突變率的影響，從分子水平研究納米材料的生物安全性。

對基因突變的鑒定，最為關鍵的是建立一個高效、穩定的檢測體系。傳統的基因擴增突變的檢測采用lac?I基因突變研究系統，它以lac?I作為突變測定的靶基因，同時以lacZ作為報告基因，通過常規的藍白顏色篩選實驗來鑒定靶基因的突變。因為PCR等技術所產生的體外基因突變是一種低頻率事件，這種根據菌落的顏色來篩選靶基因突變的方法是一種非選擇性方法，所以在進行大量分析時要消耗大量的原材料和勞動力。近年來報道的rpsl基因正向選擇系統中，只有rpsl突變型菌能夠在含有鏈霉素的平板形成菌落，實現正向選擇靶基因突變子的目的。此外，rpsl分析背景較低，因為rpsL的自發突變率低至10^-6，遠低于同類篩選體系。目前，rpsl基因正向選擇系統以其有效性和實用性成為體外基因擴增保真度檢測的有力工具。本發明即利用rpsl基因正向選擇系統考察納米材料的分子安全性問題，不需lacI突變研究系統中大量試劑的耗費，而且大大節省了對突變率檢測的工作量，可以實現大規模的突變率的篩選。

發明內容

本發明的目的在于結合分子生物學技術，提供一種利用分子生物學技術定量檢測納米材料生物安全性的方法，本方法通過在體外基因擴增反應體系中添加納米材料，利用正向選擇系統對反應產物的突變進行篩選，達到定量檢測納米材料生物安全性的目的；本方法技術先進，檢測結果準確可靠，使用成本較低。

本發明是通過以下技術方案來實現的：

一種利用分子生物學技術定量檢測納米材料生物安全性的方法，檢測方法的步驟是：

(1)納米材料的滅菌：將所檢測的納米材料除菌、滅DNA酶和RNA酶；

(2).納米材料懸浮溶液的制備；以納米材料完全懸浮且在室溫下可靜止放置至少10min而不發生聚積沉淀現象為準；

(3)體外擴增帶有rpsl基因的質粒模板：

①.體外基因擴增體系的配置：具體表現在dNTP、模板、Mg²⁺、引物的添加量應根據模板和體外擴增技術來選擇，且在上述反應體系中加入納米材料懸浮溶液；

②.基因擴增條件的設定與運行：反應體系中的預變性、變性及退火各階段的溫度和對應時間根據模板和引物融解溫度來選擇，或者反應溫度根據所用聚合酶的溫度來選擇，延伸時間根據所擴增片段的長度來選擇；

③.基因擴增產物的純化：擴增產物用限制性內切酶在37℃進行消化反應，然后純化；

(4).基因擴增產物的自身連接：經純化的擴增產物用T4?DNA連接酶在16℃連接；

(5).重組質粒的轉化和正向選擇系統：采用CaCl₂方法轉化MF101感受態細胞，轉化后的MF101細胞涂板于含氨芐青霉素的100μg/ml平板上以確定轉化細胞的總數，涂板于含氨芐青霉素和鏈霉素100μg/ml平板上以確定rpsL基因突變的總數；

(6).基因擴增突變頻率和錯誤率的計算：

突變頻率＝突變總數÷轉化細胞總數；