[發(fā)明專利]利用分子生物學(xué)技術(shù)定量檢測納米材料生物安全性的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810053171.5
• 申請(qǐng)日: 2008-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN101280341A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張治洲;沈汵超;劉清岱;楊文娟;賀林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 王來佳

1.一種利用分子生物學(xué)技術(shù)定量檢測納米材料生物安全性的方法，其特征在于：檢測方法的步驟是：

(1).納米材料的滅菌：將所檢測的納米材料除菌、滅DNA酶和RNA酶；

(2).納米材料懸浮溶液的制備；以納米材料完全懸浮且在室溫下可靜止放置至少10min而不發(fā)生聚積沉淀現(xiàn)象為準(zhǔn)；

(3).體外擴(kuò)增帶有rpsl基因的質(zhì)粒模板：

①.體外基因擴(kuò)增體系的配置：具體表現(xiàn)在dNTP、模板、Mg²⁺、引物的添加量應(yīng)根據(jù)模板和體外擴(kuò)增技術(shù)來選擇，且在上述反應(yīng)體系中加入納米材料懸浮溶液；

②.基因擴(kuò)增條件的設(shè)定與運(yùn)行：反應(yīng)體系中的預(yù)變性、變性及退火各階段的溫度和對(duì)應(yīng)時(shí)間根據(jù)模板和引物融解溫度來選擇，或者反應(yīng)溫度根據(jù)所用聚合酶的溫度來選擇，延伸時(shí)間根據(jù)所擴(kuò)增片段的長度來選擇；

③.基因擴(kuò)增產(chǎn)物的純化：擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶在37℃進(jìn)行消化反應(yīng)，然后純化；

(4).基因擴(kuò)增產(chǎn)物的自身連接：經(jīng)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物用T4?DNA連接酶在16℃連接；

(5).重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和正向選擇系統(tǒng)：采用CaCl₂方法轉(zhuǎn)化MF101感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的MF101細(xì)胞涂板于含氨芐青霉素的100μg/ml平板上以確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總數(shù)，涂板于含氨芐青霉素和鏈霉素100μg/ml平板上以確定rpsL基因突變的總數(shù)；

(6).基因擴(kuò)增突變頻率和錯(cuò)誤率的計(jì)算：

突變頻率＝突變總數(shù)÷轉(zhuǎn)化細(xì)胞總數(shù)；

錯(cuò)誤率＝突變頻率÷(130×25)；

其中130為構(gòu)成rpsL表型變化的氨基酸數(shù)，25為模板加倍數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子生物學(xué)技術(shù)定量檢測納米材料生物安全性的方法，其特征在于：所述的納米材料是指：水溶性和非水溶性產(chǎn)品、修飾與未修飾產(chǎn)品，還包括顆粒大小各異的產(chǎn)品，或者具備以上一種或多種不同性質(zhì)組合的產(chǎn)品。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子生物學(xué)技術(shù)定量檢測納米材料生物安全性的方法，其特征在于：所述的納米材料懸浮溶液是指：納米材料均勻分散在純水或者PCR緩沖液或者其它適用于基因擴(kuò)增反應(yīng)的液相中。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子生物學(xué)技術(shù)定量檢測納米材料生物安全性的方法，其特征在于：所述的體外基因擴(kuò)增技術(shù)包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、低拷貝數(shù)DNA擴(kuò)增、長片段PCR、復(fù)雜模板PCR、反復(fù)擴(kuò)增的PCR以及含有較多重復(fù)序列的DNA片段的擴(kuò)增。