[發明專利]丹酚酸酶及丹酚酸酶和人參皂苷混合酶及其轉化藥材的方法

有效

• 申請號: 200810052882.0
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101565694A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 金鳳燮;魚紅閃;閆希軍;朱永宏;周水平;張春枝
• 申請（專利權）人: 天津天士力制藥股份有限公司;金鳳燮
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N9/24;C12P7/42;C12P17/16
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• 代理人: 暫無信息

1.一種酶解丹酚酸B的方法，其特征在于：包括使丹酚酸酶與含有丹酚酸B的 藥材和/或其提取物中丹酚酸B反應的步驟，反應溫度20-70℃，反應時間為10-40 小時；所述的丹酚酸酶是能夠能水解丹酚酸B，使之變成丹參素、咖啡酸和其二 聚體化合物，來源于微生物包括黑曲霉、米曲霉、芽孢桿菌、羅倫隱球酵母菌， 丹參植物或谷物芽，所述丹酚酸酶通過下述方法制得：

用在液態或者固態用含有丹酚酸B的藥材或提取物誘導培養所述的微生 物，其中固態培養之后用緩沖液浸出、離心除渣得酶液；液態培養后，離心 除渣得酶液；所述的液態培養是加入誘導物0.1％-3％的丹參粉、或相當于 0.1％-3％丹參干物的丹參提取物，發酵培養2-8天；固態培養時加入培養基 丹參粉和/或丹參提取物，培養2-8天；

或者

將丹參植物破碎，用緩沖液浸出，離心除渣得酶液；

或者

將谷物芽破碎，用緩沖液浸出，離心除渣得酶液；所述的谷物芽是麥芽、 玉米芽或高粱芽，在谷物發芽中過程中使之接觸丹酚酸B或含有丹酚酸B的 藥材或藥材提取物，發芽溫度12-25℃，發芽時間是3-6天；

其中任選地包括將酶液濃縮，再用緩沖液溶解，除渣得丹酚酸酶濃縮液。

2.如權利要求1的方法，所述酶液濃縮的步驟，其中所述的濃縮是采取加入硫 酸銨或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的緩沖液為醋酸、磷酸、Tris或NaCl， 緩沖液的濃度為0.001-0.5M，pH為3-10。

3.一種酶處理丹參和三七混合藥材或提取物的方法，其特征是，丹酚酸酶能使 丹參中的丹酚酸B轉化為丹參素、咖啡酸和其二聚體，使三七皂苷轉化為活性更 高的Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷和苷元，包括步驟：

所述的丹酚酸酶濃縮液和丹參、三七混合藥材反應，反應溫度20-70℃，反應時 間為10-50小時；

或者

使丹參和三七的混合藥材自身的酶發揮丹酚酸酶或三七人參皂苷酶作用，包括以 下步驟：丹參和三七生藥材或者干藥材加2-20倍水、混合，泡開藥材，迅速加 熱至100℃并保持2-5分鐘，然后迅速冷卻至50℃，保持原酶活的60％以上，在 50-90℃并保持酶反應0.5-2小時；在100-120℃滅酶1-2小時；

所述的丹酚酸酶是通過下述方法制備：

在液態或者固態用丹酚酸B和三七人參皂苷誘導培養微生物，其中固態培養之后 用緩沖液浸出、離心除渣得酶液；液態培養后，離心除渣得酶液；所述的液態培 養是加入誘導物丹參粉和/或丹參提取物，以及三七人參皂苷和/或三七粉和/或 三七提取物，其量相當于0.1％-3％的藥材干物；所述固態培養時加入培養基 0.01％-30％的丹參粉和/或丹參提取物，以及三七人參皂苷和/或三七粉和/或三七 提取物，培養2-8天；所述微生物包括黑曲霉、米曲霉、芽孢桿菌、羅倫隱球酵 母菌，或者

將丹參和三七植物破碎，用緩沖液浸出，離心除渣得酶液；

或者

將谷物芽破碎，用緩沖液浸出，離心除渣得酶液；所述的谷物芽是麥芽、玉米芽 或高粱芽，在谷物發芽中過程中使之接觸含有丹酚酸B的藥材或其提取物，以及 三七人參皂苷和/或含有三七人參皂苷的藥材或其提取物，發芽溫度12-25℃， 發芽時間是3-6天；

其中任選地包括將酶液濃縮，再用緩沖液溶解，除渣得丹酚酸酶濃縮液。

4.如權利要求3的方法，所述酶液濃縮的步驟，其中所述的濃縮是采取加入硫 酸銨或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的緩沖液為醋酸、磷酸、Tris或NaCl， 緩沖液的濃度為0.001-0.5M，pH為3-10。