[發明專利]用于隱孢子蟲種屬與藍氏賈第蟲檢測的多重懸浮芯片及其制備方法

無效

• 申請號: 200810051728.1
• 申請日: 2008-12-31
• 公開（公告）號: CN101440396A
• 公開（公告）日: 2009-05-27
• 發明（設計）人: 李建華;張楠;李巍;張西臣;宮鵬濤;李淑紅
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

1.一種用于隱孢子蟲種屬與藍氏賈第蟲檢測的多重懸浮芯片，包括診斷微球和與此微球耦聯的特異性寡聚核苷酸探針，其中，寡聚核苷酸探針序列為隱孢子蟲種或屬特異或賈第蟲種特異性的基因中的序列；

隱孢子蟲種特異診斷序列：指狀U1核內小分子核糖核蛋白基因，NCBI中比對僅為人源和微小隱孢子蟲所共有，同源性均為100％，符合種特異檢測研究標準；

隱孢子蟲屬特異診斷序列：18SrRNA基因序列中保守的部分，在NCBI中比對為多個隱孢子蟲種共有，且同源性大于98％，符合屬特異檢測標準；

賈第蟲種特異診斷序列：beta-giardin；

上述的屬特異和種特異診斷序列設計特異性診斷引物及探針如下：

隱孢子蟲種特異引物H及探針ProH：

HF：5’-Biotin-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3’

HR：5’-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3

ProH探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CTTTCGGACCTCTTCCTCATC-3’

隱孢子蟲屬特異引物C及探針ProC：

CF：5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’

CR：5’-Biotin-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’

ProC探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-ACTCACCAGGTCCAGACATAG-3’

藍賈第蟲種特異引物G及探針ProG：

GF：5’-TACGCTCACCCAGACGATG-3’

GR：5’-Biotin-TCGGCGGACTTCTTGACCT-3’

ProG探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CAGCAACATGAACCAGCG-3’?

以上三段寡聚核苷酸探針序列均在5’進行NH₂-(CH₂)₁₂修飾；H上游引物、C與G的下游引物均用Biotin標記，上述引物可擴增包含上述探針序列的三段特異的診斷序列。

2.權利要求1所述懸浮芯片的制備方法，包括以下步驟：

1)制備寡聚核苷酸探針；

2)用純水稀釋氨基修飾的探針；

3)將儲備的微球振蕩，然后轉移到棕色EP管中；

4)離心收集微球，加入MES液進行振蕩；

5)向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；

6)在微球溶液中加入新配制的10mg/ml?EDC，振蕩；然后進行溫育；

7)再次向微球溶液中加入新配置的10mg/ml?EDC，振蕩，然后進行溫育；

8)向微球溶液中加0.02％Tween-20，離心收集微球；

9)用0.1％SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；

10)用血球計數板計算微球的個數，2-8℃，避光保存。?