[發(fā)明專(zhuān)利]用于隱孢子蟲(chóng)種屬與藍(lán)氏賈第蟲(chóng)檢測(cè)的多重懸浮芯片及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810051728.1
• 申請(qǐng)日: 2008-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101440396A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建華;張楠;李巍;張西臣;宮鵬濤;李淑紅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 陳宏偉

1.一種用于隱孢子蟲(chóng)種屬與藍(lán)氏賈第蟲(chóng)檢測(cè)的多重懸浮芯片，包括診斷微球和與此微球耦聯(lián)的特異性寡聚核苷酸探針，其中，寡聚核苷酸探針序列為隱孢子蟲(chóng)種或?qū)偬禺惢蛸Z第蟲(chóng)種特異性的基因中的序列；

隱孢子蟲(chóng)種特異診斷序列：指狀U1核內(nèi)小分子核糖核蛋白基因，NCBI中比對(duì)僅為人源和微小隱孢子蟲(chóng)所共有，同源性均為100％，符合種特異檢測(cè)研究標(biāo)準(zhǔn)；

隱孢子蟲(chóng)屬特異診斷序列：18SrRNA基因序列中保守的部分，在NCBI中比對(duì)為多個(gè)隱孢子蟲(chóng)種共有，且同源性大于98％，符合屬特異檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；

賈第蟲(chóng)種特異診斷序列：beta-giardin；

上述的屬特異和種特異診斷序列設(shè)計(jì)特異性診斷引物及探針如下：

隱孢子蟲(chóng)種特異引物H及探針ProH：

HF：5’-Biotin-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3’

HR：5’-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3

ProH探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CTTTCGGACCTCTTCCTCATC-3’

隱孢子蟲(chóng)屬特異引物C及探針ProC：

CF：5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’

CR：5’-Biotin-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’

ProC探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-ACTCACCAGGTCCAGACATAG-3’

藍(lán)賈第蟲(chóng)種特異引物G及探針ProG：

GF：5’-TACGCTCACCCAGACGATG-3’

GR：5’-Biotin-TCGGCGGACTTCTTGACCT-3’

ProG探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CAGCAACATGAACCAGCG-3’?

以上三段寡聚核苷酸探針序列均在5’進(jìn)行NH₂-(CH₂)₁₂修飾；H上游引物、C與G的下游引物均用Biotin標(biāo)記，上述引物可擴(kuò)增包含上述探針序列的三段特異的診斷序列。

2.權(quán)利要求1所述懸浮芯片的制備方法，包括以下步驟：

1)制備寡聚核苷酸探針；

2)用純水稀釋氨基修飾的探針；

3)將儲(chǔ)備的微球振蕩，然后轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；

4)離心收集微球，加入MES液進(jìn)行振蕩；

5)向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；

6)在微球溶液中加入新配制的10mg/ml?EDC，振蕩；然后進(jìn)行溫育；

7)再次向微球溶液中加入新配置的10mg/ml?EDC，振蕩，然后進(jìn)行溫育；

8)向微球溶液中加0.02％Tween-20，離心收集微球；

9)用0.1％SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；

10)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)，2-8℃，避光保存。?